不同碳源對(duì)海洋假單胞菌PT－8合成胞外多糖的抗氧化性的影響

張 佳 佳，屈 菲，萬 慧 萍，葉 淑 紅，劉 峻 屹，楊 富 雄

(1.大連工業(yè)大學(xué) 遼寧省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116034；2.遼寧省出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116001；3.大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

海洋微生物由于其高鹽、高壓、低溫、寡營(yíng)養(yǎng)的特殊生活環(huán)境，導(dǎo)致其體內(nèi)多糖的合成過程與陸地生物有所不同，具有產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、功能獨(dú)特的新型活性胞外多糖(extracellular polysaccha－rides，EPS)的潛力[1]。目前為止研究的海洋微生物胞外多糖在清除自由基及抗氧化方面顯示了廣泛的生物活性，因此，其作為天然抗氧化劑具有很高的開發(fā)價(jià)值。

碳源是合成微生物胞外多糖必需的營(yíng)養(yǎng)元素，因此選取的碳源不同，可能會(huì)使其合成的多糖在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等方面有所差異，進(jìn)而對(duì)多糖生物活性產(chǎn)生影響[2]。陳曉紅、Fukuda等[3－4]研究的結(jié)果表明，以不同碳源培養(yǎng)得到的胞外多糖，分子結(jié)構(gòu)、單糖組成與分子質(zhì)量分布等存在差異，而這與胞外多糖黏度變化有著一定聯(lián)系，多糖的黏度因分子質(zhì)量的增大而增加。關(guān)于不同碳源對(duì)海洋假單胞菌EPS抗氧化活性的影響研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用3種不同碳源發(fā)酵生產(chǎn)EPS，并進(jìn)行分離純化，對(duì)這3種EPS的體外抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為開發(fā)更高活性的天然抗氧化劑尋找新方法，為進(jìn)一步探討多糖構(gòu)效關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌 株

假單胞菌PT－8：由實(shí)驗(yàn)室自深海海泥中分離、鑒定并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏3g，水1 000mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖35g，牛肉膏20g，氯化鈉55g，K2HPO41g，MgSO41g，KH2PO40.5g，MnSO40.5g，水1 000mL，pH 7.5。

1.1.3 試劑與儀器

主要試劑：T－系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(M＝120、2 700、6 700ku)、DEAE－52、Sephadex G－100、1，1－二苯基苦基苯肼(DPPH)均為Sigma公司產(chǎn)品；苯酚、硫酸、1，10－菲咯啉溶液、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、三氯乙酸、過氧化氫、無水乙醇等均為分析純。

主要儀器：高效液相色譜儀(Waters)，真空冷凍干燥機(jī)，高速冷凍離心機(jī)，紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胞外多糖的制備

用醇沉法制備胞外多糖[1]，對(duì)應(yīng)不同碳源，分別命名為 EPSS、EPSG、EPSM。用苯酚－硫酸法[5]測(cè)定多糖含量，進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 HPLC測(cè)定PT－8EPS的分子質(zhì)量

HPLC檢測(cè)條件：色譜柱為 Waters UltrahydrogelTMm1000Column(7.8mm×300mm)；流動(dòng) 相 為 0.2mol／L Na2SO4；體 積 流 量 為0.5mL／min；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為20μL；最大柱壓為2.5MPa；Waters－2414示差檢測(cè)器檢測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用已知分子質(zhì)量的系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖(M＝120、2 700、6 700ku)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。

樣品的測(cè)定：多糖純品溶液進(jìn)樣20μL，根據(jù)出峰時(shí)間，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品的分子質(zhì)量。

1.3 不同碳源多糖抗氧化性的測(cè)定

1.3.1 多糖還原力的測(cè)定

鐵氰化鉀法測(cè)定多糖的還原力，以同濃度VC作陽性對(duì)照[7]。

1.3.2 多糖對(duì)二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)的清除作用

測(cè)定多糖對(duì)DPPH的清除作用，以95%乙醇調(diào)零，在517nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1，無水乙醇代替DPPH溶液的吸光度為A2，無水乙醇代替樣品溶液的吸光度值為A0。以同濃度VC代替多糖作對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 多糖對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用

采用Fenton體系測(cè)定多糖對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用，以蒸餾水調(diào)零，以VC作對(duì)比[8]。清除率按式(2)計(jì)算：

式(2)中：A′0為不加樣品、加入過氧化氫時(shí)的吸光度；A′1為加入樣品和過氧化氫時(shí)的吸光度；A′2為不加樣品和過氧化氫時(shí)的吸光度。

1.3.4 多糖對(duì)超氧陰離子自由基(O－2·)的清除作用

鄰苯三酚自氧化法測(cè)定多糖對(duì)超氧陰離子自由基(O－2·)的清除作用，結(jié)果按式(3)計(jì)算：

式(3)中：A″0為不加樣品、加入鄰苯三酚時(shí)的吸光度；A″1為加入樣品和鄰苯三酚時(shí)的吸光度；A″2為加入樣品、不加鄰苯三酚時(shí)的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)和EPS合成量的影響

假單胞菌PT－8能利用供試的3種碳源生長(zhǎng)并合成EPS，其中以蔗糖為碳源時(shí)EPS合成量最大，達(dá)到6.98g／L，以葡萄糖和麥芽糖為碳源時(shí)EPS的產(chǎn)量相對(duì)較少，分別為6.35和5.93g／L。研究發(fā)現(xiàn)生物量和EPS產(chǎn)量呈現(xiàn)出一定相關(guān)性，生物量高的培養(yǎng)基中EPS的合成量也較大。

2.2 不同碳源合成的EPS的分子質(zhì)量

多糖的構(gòu)效關(guān)系非常復(fù)雜，其中多糖的分子質(zhì)量大小是影響多糖生物活性的一個(gè)重要因素[9]。本實(shí)驗(yàn)中采用HPLC測(cè)定3種多糖的分子質(zhì)量，洗脫曲線如圖1所示，均呈單一對(duì)稱的峰，表明3種多糖都是均一多糖。

圖1 HPLC測(cè)定 EPSS、EPSG、EPSM 的分子質(zhì)量分布Fig.1 Molecular weight distribution of EPSS，EPSG，EPSMdetermined by HPLC

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線lgM＝11.282 7－0.331 6t(R2＝0.998)，計(jì)算得 EPSS、EPSG、EPSM的分子質(zhì)量分別為7.3、17.8和19.2ku，其中EPSs分子質(zhì)量最小。結(jié)果說明假單胞菌PT－8以不同碳源合成的多糖分子質(zhì)量不同，這可能會(huì)導(dǎo)致多糖溶解度、黏度等的不同，進(jìn)而影響其生理活性[10]。

2.3 不同碳源合成的EPS的抗氧化性

2.3.1 還原力的測(cè)定

還原力的大小與抗氧化活性有著密切的關(guān)系，是用來評(píng)價(jià)抗氧化劑活性的常用方法。由圖2可知，不同的多糖濃度和供試組分對(duì)還原力有著明顯的影響，還原力的大小隨著多糖濃度的增加而增加，但EPSS、EPSG和EPSM各濃度下的還原力均小于VC。對(duì)EPSS、EPSG、EPSM的對(duì)比分析可知，EPSS的還原力大于EPSG和EPSM，其余兩種多糖的還原力差別不明顯，可見低分子質(zhì)量的多糖表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原力。

圖2 EPS和VC的還原力Fig.2 The reducing power of EPS and VC

2.3.2 多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用

由圖3可以看出，在實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，供試的3種多糖對(duì)DPPH均有一定程度的清除能力，但均小于VC。EPSS、EPSG、EPSM對(duì)DPPH·的清除能力均隨著濃度的增加而緩慢增加，但仍呈上升趨勢(shì)。3種不同碳源多糖對(duì)DPPH·的清除能力強(qiáng)弱依次為EPSS＞EPSG＞EPSM。

圖3 EPS和VC對(duì)DPPH·的清除作用Fig.3 The scavenging effect of EPS and VCon DPPH·

2.3.3 多糖對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用

如圖4所示，3種不同碳源胞外多糖清除·OH的能力呈量效關(guān)系。不同碳源多糖對(duì)·OH的清除能力優(yōu)于VC，具有較強(qiáng)的清除·OH的能力。3種不同碳源多糖對(duì)·OH的清除能力強(qiáng)弱依次為EPSS＞EPSG＞EPSM。

圖4 EPS和VC對(duì)·OH的清除率Fig.4 The scavenging ability of EPS and VCto·OH

2.3.4 多糖對(duì)超氧陰離子自由基(O－2·)的清除作用

由圖5可知，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度達(dá)到0.3mg／mL時(shí)，EPSS、EPSG、EPSM對(duì)O－2·的清除率分別達(dá)到83.65%、25.17%、18.68%，均小于同濃度下的VC，其清除率為93.43%。EPSS清除O－2·的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過EPSG、EPSM而接近于VC。EPSG清除O－2·的能力略微大于EPSM。3種不同碳源多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力強(qiáng)弱依次為EPSS＞EPSG＞EPSM。

圖5 EPS和VC對(duì)O－2·的清除率Fig.5 The scavenging ability of EPS and VCto O－2·

還原力和清除自由基能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度條件下，3種不同碳源合成的多糖均有一定的還原力和清除自由基的能力，并隨著多糖質(zhì)量濃度的增加逐漸增強(qiáng)。其中清除羥自由基和超氧陰離子自由基的能力較強(qiáng)，但在同一濃度下的還原力和清除DPPH自由基能力均小于VC。通過對(duì)比不同碳源EPS的抗氧化能力發(fā)現(xiàn)，其強(qiáng)弱順序依次為EPSS＞EPSG＞EPSM，這與分子質(zhì)量大小順序一致，即分子質(zhì)量小的EPSS的抗氧化性最強(qiáng)，而EPSG和EPSM的分子質(zhì)量接近，它們的抗氧化活性也沒有明顯差別，研究表明這并不是巧合，如張凡華[11]研究的南瓜小分子質(zhì)量的多糖顯示了較好的抗氧化活性。說明分子質(zhì)量大小與多糖的抗氧化能力之間存在密切聯(lián)系。其原因可能是分子質(zhì)量越大，體積越大，越不利于多糖跨越多重細(xì)胞膜障礙進(jìn)入生物體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)活性，分子質(zhì)量小的多糖通常具有溶解性好、黏度低等優(yōu)勢(shì)，使其更容易結(jié)合活性位點(diǎn)。但分子質(zhì)量過低也無法形成產(chǎn)生活性的聚合結(jié)構(gòu)[12]。因此，分子質(zhì)量大小適當(dāng)?shù)亩嗵腔钚暂^高。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了不同碳源對(duì)假單胞菌PT－8合成胞外多糖的產(chǎn)量、分子質(zhì)量及其體外抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，假單胞菌PT－8可利用不同碳源合成不同產(chǎn)量的胞外多糖，且不同碳源合成的多糖分子質(zhì)量不同；抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分子質(zhì)量小的多糖抗氧化活性更強(qiáng)，這一結(jié)果與之前國(guó)外的有關(guān)報(bào)道[13]一致，對(duì)于該菌株所產(chǎn)胞外多糖的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系研究以及用于抗氧化劑的生產(chǎn)有一定意義。

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