響應(yīng)面法優(yōu)化榆耳多糖脫蛋白工藝

蔣 春 燕，李 代，侯 紅 漫，張 公 亮

(1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司，遼寧 大連 116113)

0 引 言

榆耳別名榆蘑，是一種樹生腐生真菌，其子實體及發(fā)酵菌絲體可入藥，榆耳子實體含有蛋白質(zhì)、多糖和多種維生素等營養(yǎng)成分[1]。榆耳多糖屬于真菌多糖，真菌多糖具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種生物功效[2－3]。關(guān)于榆耳子實體、發(fā)酵液及發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性[4]報道較多，榆耳多糖作為榆耳中主要的活性成分，也已開始受到人們關(guān)注[5]。多糖脫蛋白時多采用傳統(tǒng)Sevag法，該法有機(jī)溶劑用量大、復(fù)雜、費時，通常需要重復(fù)多次，存在多糖損失等問題[6]。酶法反應(yīng)溫和，酶可以水解少量與多糖結(jié)合牢固或被多糖包裹的蛋白，將糖釋放出來，從而提高多糖粗產(chǎn)品得率，脫蛋白常用的酶有木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶[7]。實驗選用多種酶脫蛋白以確定最佳蛋白酶，再根據(jù)單因素和響應(yīng)面分析法[8]確定了脫蛋白最佳條件。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

榆耳菌絲體，深層發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)獲得；木瓜蛋白酶，酶活(1.29±0.32)×105U／g，pH 6.0、60℃下測定；堿性蛋白酶，酶活(2.23±0.19)×105U／g，pH 9.0、50℃下測定；復(fù)合蛋白酶，酶活(1.11±0.39)×105U／g，pH 6.0、50℃下測定；中性蛋白酶，酶活(2.35±0.21)×105U／g，pH 7.0、50℃下測定；均為分析純，廣西南寧龐博生物有限公司。

SC－3610低速離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；UV2100型紫外分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；冷凍離心機(jī)，天美科學(xué)儀器有限公司；電子精密天平，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 榆耳菌絲體多糖的提取

稱取榆耳菌絲體粉末30g，按水料比40∶1加入蒸餾水，80℃下熱水浸提8h，離心(4 000r／min，10min)。反復(fù)提取3次，收集上清液濃縮至原體積的1／5，加3倍體積無水乙醇，4℃過夜，離心(4 000r／min，10min)，收 集 沉 淀。 將 沉 淀 于40℃烘干，用去離子水復(fù)溶，離心(4 000r／min，15min)得上清液即為水溶性粗多糖[9－10]。用苯酚硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法測定水溶性粗多糖溶液中多糖和蛋白含量。

1.2.2 不同酶法脫蛋白

取4份10mL(10mg／mL)榆耳粗多糖溶液，分別加入相同活力單位的木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，調(diào)至相應(yīng)酶反應(yīng)的最適pH，在最適溫度下水浴3h后煮沸滅酶10min，使酶失活沉淀(每種酶作3個平行)，離心(10 000r／min，10min)，取上清液，加入無水乙醇(使乙醇占整個體積的80%)，4℃條件下放置過夜，離心，將多糖沉淀烘干，復(fù)溶，最后測蛋白和多糖的含量，根據(jù)蛋白去除率和多糖損失率確定最佳蛋白酶。

1.2.3 木瓜蛋白酶法脫蛋白的單因素實驗

木瓜蛋白酶溶液的制備：用100mL pH 6.0的去離子水溶解木瓜蛋白酶，使酶液終濃度為2 000U／mL。木瓜蛋白酶的單因素條件：酶液與多糖溶液體積比分別為0.10∶1、0.15∶1、0.20∶1、0.25∶1、0.30∶1，酶解時間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，酶解溫度分別為40、50、60、70、80℃，pH 分別為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5。

1.2.4 分析方法

(1)榆耳菌絲體多糖含量的測定：苯酚－硫酸法。

(2)蛋白含量的測定：采用考馬斯亮藍(lán)G－250法。

式中：A0為脫蛋白前樣品中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，A1為脫蛋白后樣品中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式中：B0為脫蛋白前樣品中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，B1為脫蛋白后樣品中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.5 酶法脫蛋白條件的響應(yīng)面分析

采用Box－behnken實驗方案，根據(jù)單因素的實驗結(jié)果，運用RSREG(response surface regression)程序?qū)嶒烖c的響應(yīng)值進(jìn)行系統(tǒng)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同酶法除蛋白結(jié)果

根據(jù)“1.2.2”的實驗方法分別用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶脫除榆耳粗多糖蛋白后得多糖組分，分別命名為 M、N、S、T。由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.123x－0.006 3，R2＝0.999及蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.005 5x＋0.012 1，R2＝0.994 9和“1.2.4”中公式計算所得結(jié)果如圖1所示。

圖1 4種酶的脫蛋白效果比較Fig.1 The results of deproteinization by four enzymes

由圖1可看出，在4種酶中，木瓜蛋白酶的脫蛋白效果最好(P＜0.01)，蛋白去除率為56%；其次為復(fù)合蛋白酶，蛋白去除率達(dá)47%；堿性蛋白酶和中性蛋白酶脫蛋白效果不理想。這一結(jié)果與不同酶對紅松松塔粗多糖和大棗多糖除蛋白工藝的研究結(jié)果基本相符[11－12]。因此，在多糖損失率相差不大的條件下選擇木瓜蛋白酶作單因素實驗，探索其除蛋白的最佳條件。

2.2 木瓜蛋白酶除蛋白單因素條件探索

2.2.1 酶液與多糖樣液體積比對水解反應(yīng)的影響

從圖2可以看出，當(dāng)溶液pH為6.0，在60℃水浴中水解3h后，隨酶加入量的增大，反應(yīng)越來越完全。當(dāng)酶液與樣液體積比為0.20∶1時，蛋白去除率較高而多糖損失率相對較小。這一結(jié)果與趙燕珠等[13]的研究結(jié)果基本相符。因此，確定后續(xù)單因素實驗中酶液與糖液體積比為0.20∶1。

圖2 酶液與樣液體積比對脫蛋白的影響Fig.2 Influence of different ratio of liquid on deproteinization

2.2.2 酶解時間對水解反應(yīng)的影響

由圖3可看出蛋白去除率隨酶解時間延長而增加，在3.0h時蛋白去除率最大為71.5%，隨后趨于穩(wěn)定。多糖損失率則隨時間的延長變化幅度不大，保持在7.8%～17.5%，這一結(jié)果與高星燁等[11]的研究結(jié)果類似。因此，在多糖損失率變化幅度不大的情況下，確定最佳酶解時間為3h。

圖3 酶解時間對脫蛋白的影響Fig.3 Influence of time on deproteinization

2.2.3 酶解溫度對水解反應(yīng)的影響

從圖4可以看出，蛋白去除率在40～60℃隨著溫度的升高而變大，在60℃后變化不大；多糖損失率在40～70℃變化不大，但70℃后逐漸增大。這是因為木瓜蛋白酶作用時，需要一定的溫度來提高酶的活力，溫度升高，可增加酶液在溶液中的滲透動力，酶才能與蛋白質(zhì)分子充分作用，但溫度過高則會導(dǎo)致酶失活。因此，在保持較低多糖損失率情況下，確定60℃為最佳蛋白脫除效果的酶解溫度。

圖4 酶解溫度對脫蛋白的影響Fig.4 Influence of temperature on deproteinization

2.2.4 pH對水解反應(yīng)的影響

從圖5可以看出，蛋白去除率在pH 3.5～6.0隨著時間的增加而變大，隨后呈現(xiàn)下降趨勢；多糖損失率隨pH的增大呈現(xiàn)波動狀態(tài)。這可能是由于木瓜蛋白酶的化學(xué)本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，它在水解體系中的解離狀態(tài)和行為要受溶液pH的影響。因此，在保持較高蛋白去除率情況下，確定最佳pH為6.0。

圖5 pH對脫蛋白的影響Fig.5 Influence of pH on deproteinization

2.3 中心復(fù)合響應(yīng)面優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，水解時間選為3h，以酶解溫度、酶液與糖液的體積比和pH為變化量，以蛋白去除率／多糖損失率(即蛋白去除率與多糖損失率的比值)為響應(yīng)值Y，運用響應(yīng)面程序，對木瓜蛋白酶除蛋白的條件進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面分析水平和結(jié)果見表1和表2。

表1 酶法脫蛋白的響應(yīng)面分析水平和因素Tab.1 Design of experimental factors and levels of deproteinization by enzyme

表2 酶法脫蛋白的響應(yīng)面分析方案和結(jié)果Tab.1 Design and results of response surface experimental of deproteinization by enzyme

為了能準(zhǔn)確估計實驗誤差，需要對中心點進(jìn)行5次平行實驗。繼續(xù)用RSREG程序?qū)Ρ?中所得結(jié)果進(jìn)行程序分析，結(jié)果見表3。

由表3中數(shù)據(jù)分析可得榆耳多糖的Y與不同提取因素間的擬合方程：

回歸方程P值越小，與之對應(yīng)變量的顯著性就越高，A、A2、B2和C2對響應(yīng)值的變化起了明顯的作用，3個影響因素與Y的變化不是單一的線性關(guān)系。其中，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2＝0.974 8可以解釋方程擬合度很高。所以，可以用此方程來優(yōu)化酶法除蛋白方法。通過分析結(jié)果可以作出相應(yīng)的等高線圖及其曲面圖，以確認(rèn)溫度、酶液與樣液體積比和pH 3個因素對蛋白去除率與多糖損失率的比值的影響，結(jié)果見圖6。

表3 酶法脫蛋白的回歸結(jié)果與分析Tab.1 Regression results and analysis of deproteinization by enzyme

圖6 響應(yīng)面立體分析圖Fig.6 Responsive surface plot

由圖6(a)可以看出，當(dāng)C取中心水平時，A和B對Y(蛋白去除率與多糖損失率的比值)的交互作用不顯著。當(dāng)A取不同值時，B對Y的影響表現(xiàn)出不同程度的變化；同理，當(dāng)B取不同值時，A對Y的影響也表現(xiàn)出不同程度的變化。從單個因素對Y的影響看，A的變化對Y的顯著性要大于B，即溫度對Y影響的顯著性大于酶液與樣液體積比。

由圖6(b)可以看出，當(dāng)B取中心水平時，A和C對Y的交互作用顯著。但從單個因素對Y的影響看，A的變化對Y的顯著性要大于C，即溫度對Y影響的顯著性大于pH。

由圖6(c)可以看出，當(dāng)A取中心水平時，B和C對Y的交互作用不太顯著。從單個因素對Y的影響看，C影響的顯著性要大于B，即pH對Y影響的顯著性大于酶液與樣液比。

為檢驗響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，確定木瓜蛋白酶除蛋白的最優(yōu)條件，根據(jù)軟件優(yōu)化出的各因素水平最佳取值，經(jīng)軟件計算得：酶解溫度＝58℃，V(酶液)∶V(樣液)＝0.21∶1，pH＝6.13；此條件下蛋白去除率為67.52%，多糖損失率為15.57%。

3 結(jié) 論

分別用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶去除榆耳多糖中蛋白，結(jié)果顯示木瓜蛋白酶除蛋白效果較好。對木瓜蛋白酶除蛋白進(jìn)行單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實驗最后確定最優(yōu)條件為：酶液與糖液的體積比為0.21∶1，酶解時間為3h，酶解溫度為58℃，pH為6.13。經(jīng)軟件計算此條件下所得蛋白去除率與多糖損失率比值理論值為4.499，實測值為4.337，預(yù)測值與理論值接近，偏差較小。

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