海參溶菌酶C端多肽在畢赤酵母中的重組表達

姜 啟 晨，叢 麗 娜，宋 明 徽，譚 廣 毅，盧 冬

(大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

溶菌酶(Lysozyme，EC3.2.1.17)，是一種堿性蛋白酶，專門作用于細菌的細胞壁，使細菌細胞壁中的N－乙酰胞壁酸和N－乙酰葡萄糖胺之間的β－1，4糖苷鍵斷裂，導致細菌細胞發(fā)生裂解，產(chǎn)生溶菌現(xiàn)象，從而起到殺死細菌的作用。它廣泛存在于動植物和微生物的組織、體液及分泌物中，在生物機體的免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[1]，是天然的抗菌劑、免疫增強劑和防腐劑[2]。研究表明，溶菌酶可以與帶負電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，還可以同DNA、RNA和脫輔基蛋白形成復鹽，從而使病毒失活[3]。

海參溶菌酶屬于i－型溶菌酶[4]，與蛋清c－型溶菌酶不同，i－型溶菌酶不但可以對革蘭陽性菌有抑菌作用，對于能引起水產(chǎn)生物病害的革蘭陰性菌同樣具有抑菌效果[5]。海參溶菌酶具有異構(gòu)肽活性，也稱為它的非酶活性，這與該溶菌酶基因的C端區(qū)域的DNA結(jié)構(gòu)有關[6]。常藝海等[7]已將海參溶菌酶C端多肽基因在大腸桿菌原核細胞中得到高效表達。本研究采用具有易操作、高級的蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾功能和高穩(wěn)定性等特點[8]的真核畢赤酵母表達系統(tǒng)，將海參溶菌酶C端多肽基因連接到表達載體pPIC9K上進行分泌表達，以期為進一步研究和生產(chǎn)海參溶菌酶C端多肽高活性產(chǎn)品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

畢赤酵母 GS115、表達載體pPIC9K，Invitrogen公司；大腸桿菌DH5α和克隆載體pMD18－T，TaKaRa 公 司；pMD18－T－SjLys－C／DH5α，本實驗室構(gòu)建并保藏。

1.1.2 試劑與工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶(EcoRⅠ、NotⅠ、BglⅡ)、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、即用型蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準、DNA Ladder Marker，TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒，TIANGEN生化科技(北京)有限公司；Geneticin(G418)，索萊寶科技(北京)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 特異性引物設計

以海參溶菌酶C端多肽基因[6]為模版，利用Primer Premier 5.0軟件，設計用于真核細胞表達系統(tǒng)的特異性引物 HS－C－1，HS－C－2，并分別添加EcoRⅠ和NotⅠ限制性酶切位點(下劃線表示)：

HS－C－1：GCGTGAATTCGTGATGGGAGGTAGTCTGG；

HS－C－2：TGCGGCCGCCTACTCAGTTGTTGCTC。

1.2.2 SjLys－C基因的擴增

以本 實 驗 室 構(gòu) 建 好 的 pMD18－T－SjLys－C／DH5α菌株提取的質(zhì)粒為模板，PCR反應循環(huán)參數(shù)為94℃5min；94℃30s，62℃30s，72℃50s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物與pMD18－T Vector在T4DNA連接酶作用下進行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18－T－SjLys－C并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(DH5α)感受態(tài)細胞中，取200μL涂布于含適量Amp、X－Gal、IPTG的LB平板培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。挑選出經(jīng)菌落PCR和雙酶切驗證正確的陽性菌株，送北京華大基因測序公司測序驗證。

1.2.3 構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pPIC9K－SjLys－C

將測序驗證的正確的克隆質(zhì)粒pMD18－TSjLys－C和表達載體pPIC9K分別用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，回收SjLys－C目的基因和帶有黏性末端的pPIC9K載體，在T4DNA連接酶作用下16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至DH5α菌株中。將經(jīng)菌落PCR和雙酶切驗證及測序驗證正確后的重組表達質(zhì)粒命名為pPIC9K－SjLys－C。

1.2.4 pPIC9K－SjLys－C 轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115及篩選

將GS115感受態(tài)細胞和經(jīng)BglⅡ線性化的pPIC9K－SjLys－C相混合，將其放入預冷的2mm的電轉(zhuǎn)杯中，置于冰上10min，在1.5kV、200Ω的條件下電擊，反應完成后立即加入1mL預冷的1mol／L的山梨醇，取350μL涂布于 MD平板，30℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，再將轉(zhuǎn)化子經(jīng)96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，最后將轉(zhuǎn)化子點種到不同濃度抗生素G418(0.5～4.0mg／mL)的YPD平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)，直至長出單菌落。

1.2.5 SjLys－C基因的誘導表達

將在含G418 4.0mg／mL的YPD平板上生長的重組畢赤酵母菌株接種到10mL的BMGY液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，30℃、220r／min搖床培養(yǎng)18h，再按1%的接種量將其轉(zhuǎn)接到25mL的BMGY培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，30℃、230r／min擴大培養(yǎng)20～24h，當菌液OD600達到4.0～5.0時，4 000r／min、4 ℃ 離心10min，棄上清，用25mL BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，30℃、250r／min振蕩培養(yǎng)，每隔24h取樣1mL同時加入純甲醇至培養(yǎng)液中甲醇為1.0%進行誘導表達，培養(yǎng)至96h。將誘導表達液在15 000r／min離心5min，上清液經(jīng)TCA濃縮，沉淀其蛋白，進行SDSPAGE電泳檢測。

1.2.6 重組海參溶菌酶C端多肽的抑菌活性分析

采用管碟法[9]對重組海參溶菌酶C端多肽進行抑菌活性分析。選取革蘭陽性菌溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、革蘭陰性菌副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)作為指示菌，分別取上述指示菌培養(yǎng)液200μL(濃度2.9×109CFU／mL，稀釋倍數(shù)10－4)均勻涂布于LB固體平板培養(yǎng)基上，放入無菌牛津杯，向其加入200μL重組畢赤酵母基因工程菌的發(fā)酵液，30℃培養(yǎng)18h，測定抑菌圈直徑。重復3次，取實驗結(jié)果平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 SjLys－C基因的擴增與重組克隆質(zhì)粒的鑒定

以海參溶菌酶C端多肽基因為模版，設計特異性引物 HS－C－1和 HS－C－2，分別帶有EcoRⅠ和NotⅠ限制性酶切位點，經(jīng)PCR反應得到長度約為260bp擴增產(chǎn)物(圖1)，與預期大小一致。將構(gòu) 建 好 的 pMD18－T－SjLys－C 用EcoRⅠ 和NotⅠ進行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示目的帶大小與預計一致。再將提取的重組質(zhì)粒進行測序驗證，結(jié)果表明它與SjLys－C基因序列[10]完全一致，這表明重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 PCR擴增目的基因Fig.1 Amplification of the target DNA by PCR

2.2 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及驗證

將測序驗證正確的pMD18－T－SjLys－C 和pPIC9K分別用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，二者過夜連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒并進行雙酶切和菌落PCR驗證。結(jié)果表明在260bp出現(xiàn)目的條帶(圖2)，將該重組質(zhì)粒進行測序，它與SjLys－C基因序列[10]完全一致，這表明重組表達質(zhì)粒pPIC9K－SjLys－C構(gòu)建成功。

2.3 重組海參溶菌酶C端多肽的誘導表達

圖2 重組表達質(zhì)粒pPIC9K－SjLys－C的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid pPIC9K－SjLys－C digested by EcoRⅠand NotⅠ

將線性化的重組質(zhì)粒pPIC9K－SjLys－C電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中，篩選高拷貝的工程菌株，其培養(yǎng)液加1%甲醇誘導表達96h，分別收集不同時間發(fā)酵液的上清液，采用12%的SDS－PAGE電泳進行目的蛋白表達分析。海參溶菌酶C端多肽基因經(jīng)生物學軟件分析，它編碼77個氨基酸，預測分子質(zhì)量為8.72ku。由圖3可見，泳道2～5在分子質(zhì)量為8.8ku附近出現(xiàn)明顯的目的條帶，而作為陰性對照的第一泳道在8.8ku處無條帶出現(xiàn)，證明海參溶菌酶C端多肽在畢赤酵母GS115中得到成功表達且72h目的蛋白表達量最高。

圖3 重組海參溶菌酶C端多肽的SDSPAGE分析Fig.3 Expression of the recombinant SjLys－C by SDS－PAGE analysis

2.4 重組海參溶菌酶C端多肽的抑菌實驗

采用管碟法測定重組海參溶菌酶C端多肽的抑菌活性。結(jié)果顯示，該重組海參溶菌酶C端多肽對實驗選用的4種指示菌均有不同程度的抑菌效果，其中對革蘭陽性菌M.lysodeikticus和S.aureus的抑菌直徑分別為10和9mm，對革蘭陰性菌V.parahaemolyticus和P.aeruginosa的抑菌直徑分別為17和16mm(標準差為0.45～0.61mm)。這表明重組海參溶菌酶C端多肽對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌具有廣譜抗菌作用(圖4)，尤其對引起海洋生物病害的主要致病菌副溶血弧菌和銅綠假單胞菌有更強的抑菌作用。

圖4 重組海參溶菌酶C端多肽的抑菌活性Fig.4 The antibacterial activity of the recombinant SjLys－C

3 結(jié) 論

通過PCR的方法成功擴增出海參溶菌酶C端多肽基因，構(gòu)建成表達質(zhì)粒pPIC9K－SjLys－C，將其線性化后經(jīng)電轉(zhuǎn)化導入GS115中，構(gòu)建并篩選出高拷貝的基因工程菌pPIC9K－SjLys－C／GS115。該工程菌的甲醇誘導發(fā)酵液經(jīng)SDSPAGE電泳檢測，結(jié)果成功得到重組海參溶菌酶C端多肽目的蛋白。對重組海參溶菌酶C端多肽進行抑菌活性分析，重組海參溶菌酶C端多肽對革蘭陽性菌溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌、革蘭陰性菌副溶血弧菌和銅綠假單胞菌均有不同程度的抑菌效果，其中副溶血弧菌和銅綠假單胞菌是水產(chǎn)生物的主要致病菌，對于海水魚類、甲殼類等多種水產(chǎn)動物具有嚴重危害，而海參溶菌酶C端多肽對這兩種致病菌均顯示出了較強的抑菌效果。

畢赤酵母表達系統(tǒng)是當前世界應用最為廣泛的酵母表達系統(tǒng)，它不僅具有高表達、高分泌和高穩(wěn)定的特點，而且可以進行翻譯后的加工處理將目的蛋白分泌到細胞外，美國FDA已經(jīng)評定畢赤酵母表達系統(tǒng)產(chǎn)生的基因工程產(chǎn)品是安全的。因此將具有抗菌活性的海參溶菌酶C端片段置于畢赤酵母表達系統(tǒng)中，利用工程菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)大量的抗菌多肽產(chǎn)品，這對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病害的預防具有非常重大的意義。本研究為進一步研究海參溶菌酶結(jié)構(gòu)與功能及其C端多肽在真核系統(tǒng)中的表達奠定了基礎，也為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)。

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