3種常見醫(yī)藥品對(duì)發(fā)光菌聯(lián)合毒性作用研究

董玉瑛，朱行翠，仉春華

(大連民族學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧大連116605)

長期以來，人類藥品在保障人們健康、延長人類壽命、改善人民生活水平等方面起到重要的作用。但是這些藥物中的活性醫(yī)藥成分(Active Pharmaceutical Ingredient，APIs)(如原料藥或藥物的代謝物)能夠釋放到環(huán)境中，產(chǎn)生潛在的環(huán)境危害。近年來在排水、水源地水、管道水、飲用水中，都檢測到了人類使用的各種醫(yī)藥品的存在［1-3］。然而，目前對(duì)醫(yī)藥物質(zhì)的研究主要集中在臨床應(yīng)用、體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)等方面，從生態(tài)毒理學(xué)角度進(jìn)行的APIs進(jìn)入環(huán)境后的毒性效應(yīng)研究較少。人們對(duì)這些APIs的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)性了解甚微，更無法預(yù)測暴露于含有這些混合藥物的環(huán)境后可能發(fā)生的后果［4］。

本文結(jié)合發(fā)光菌快速、靈敏、價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)，將其作為指示生物測定了阿司匹林、環(huán)丙沙星和阿奇霉素3種常用藥品對(duì)發(fā)光菌的單一毒性，獲得EC50值;同時(shí)測試了3種藥品在等濃度配比下的二元、三元混合體系的聯(lián)合毒性。采用毒性單位(TU)法、相加指數(shù)(AI)法、混合毒性指數(shù)(MTI)法等聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法，判斷其聯(lián)合作用機(jī)制，并分析環(huán)境中藥品殘留問題的風(fēng)險(xiǎn)性。

1 材料與方法

1.1 材料

阿司匹林腸溶片(湖南新匯制藥有限公司)，鹽酸環(huán)丙沙星片(哈藥集團(tuán)制藥總廠)，阿奇霉素分散片(沈陽恩世制藥有限公司)。明亮發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum)凍干粉購自中國科學(xué)院南京土壤研究所微生物室。

1.2 儀器

DXY-2型生物毒性測試儀(中國科學(xué)院南京土壤研究所制造)，85-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)，THZ-82氣浴恒溫振蕩器(江蘇金壇儀器廠)，DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，LDZX-40CI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)，不同量程的精密移液器(Thermo公司)，SJH型潔凈工作臺(tái)(沈陽市凈化儀器廠二分廠)，常規(guī)玻璃儀器。

1.3 試劑

培養(yǎng)液:酵母浸出汁5.0 g，胰蛋白胨5.0 g，氯化鈉(NaCl)30.0g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)5.0 g，磷酸二氫鉀(KHm2PO4)1.0 g，甘油 3.0 g，蒸餾水1 000 mL。

固體培養(yǎng)基:培養(yǎng)液(按以上配方)100 mL，瓊脂粉6 g。

稀釋液:2%NaCl，3%NaCl。

待測物:阿司匹林腸溶片(湖南新匯制藥有限公司)、鹽酸環(huán)丙沙星片(哈藥集團(tuán)制藥總廠)、阿奇霉素分散片(沈陽恩世制藥有限公司)。

1.4 菌種的培養(yǎng)

發(fā)光菌凍干粉劑的復(fù)蘇、斜面菌種的培養(yǎng)、搖瓶菌液的培養(yǎng)、工作菌液的制備等過程見文獻(xiàn)［5］。

1.5 單一毒性EC50的測定

(1)預(yù)試驗(yàn):將藥品研磨配制水溶液，以逐級(jí)10倍稀釋法選擇高、中、低3個(gè)試驗(yàn)濃度進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，獲得接近100%、0%抑制率的APIs濃度。另外抑制率在50%左右的APIs濃度也需要計(jì)算，以作為正式試驗(yàn)的布點(diǎn)參考。

(2)單一毒性試驗(yàn):根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，將待測溶液用3%NaCl溶液稀釋配制成10～15個(gè)濃度梯度，各取4.5 mL加入具塞磨口比色管(φ 1.5 cm，h6cm)，以4.5 mL 3%NaCl溶液作空白對(duì)照。每個(gè)濃度梯度設(shè)3組平行。將培養(yǎng)好的工作菌液取0.5 mL于各比色管中(控制空白對(duì)照管發(fā)光強(qiáng)度為300～900 mV)，加塞充分振蕩，去塞，暴露15 min，用生物毒性測試儀測定暴露于不同APIS溶液中發(fā)光菌的發(fā)光強(qiáng)度。

1.6 聯(lián)合毒性EC50的測定

按等濃度比配制3種APIs的二元及多元混合體系，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)6個(gè)不同濃度，測定混合體系對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性EC50值，實(shí)驗(yàn)步驟與單一毒性EC50測定相同。

1.7 數(shù)據(jù)處理

毒性效應(yīng)結(jié)果用相對(duì)抑制率表示:

采用Origin7.5繪圖軟件，以APIS濃度為橫坐標(biāo)、相對(duì)抑制率為縱坐標(biāo)繪制毒性測試曲線。并在相對(duì)抑制率為50%附近的點(diǎn)進(jìn)行回歸分析，求得回歸方程，用直線內(nèi)插法求出該種APIs對(duì)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度抑制率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)得濃度，即為 EC50。

1.8 聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法

本文采用毒性單位法(TU)、相加指數(shù)法(AI)和混合毒性指數(shù)法(MTI)3種聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法，其中各參數(shù)的計(jì)算和意義見文獻(xiàn)［6］。

2 結(jié)果與討論

2.1 單一毒性測試分析

測定了3種APIs對(duì)發(fā)光細(xì)菌的單一毒性，其生物毒性測試曲線見圖1-圖3。從圖中可以觀察到單一APIs對(duì)發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度的抑制曲線呈現(xiàn)單調(diào)非線性遞增趨勢，整個(gè)圖線大致呈現(xiàn)“S”型。APIs對(duì)生物的毒害程度與其在環(huán)境中的濃度存在著很大的相關(guān)性［7］。

圖1 阿司匹林的抑制曲線

圖2 環(huán)丙沙星的抑制曲線

圖3 阿奇霉素的抑制曲線

由3種APIs對(duì)發(fā)光細(xì)菌的單一毒性，計(jì)算求得其EC50結(jié)果見表1。由表1可以看出，3種APIs對(duì)發(fā)光菌的發(fā)光強(qiáng)度表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其EC50值大小順序?yàn)?環(huán)丙沙星＞阿奇霉素＞阿司匹林。進(jìn)而可知，環(huán)丙沙星的生物毒性最小，環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)也最低;阿司匹林的對(duì)環(huán)境的毒性危害最大，進(jìn)入環(huán)境后的風(fēng)險(xiǎn)性也較其余2種藥品的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)高。

表1 3種醫(yī)藥物質(zhì)的單一毒性作用

2.2 聯(lián)合毒性測試分析

實(shí)際環(huán)境中往往是多種污染物共存，它們彼此影響，能大大改變某一或某些污染物的生物活性或毒性，使得環(huán)境污染往往表現(xiàn)為多種污染的綜合作用，單一物質(zhì)的測定不能滿足實(shí)際環(huán)境保護(hù)的需要，因此研究環(huán)境中多種污染物的復(fù)合作用規(guī)律與機(jī)制，了解污染物的復(fù)合生態(tài)環(huán)境效應(yīng)及其與單個(gè)化合物污染影響的差異，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本文分別測定了3種APIs的二元及三元混合體系對(duì)發(fā)光細(xì)菌的聯(lián)合毒性，結(jié)果見表2。

表2 混合體系聯(lián)合毒性作用

由表2可知，3種APIs的二元混合體系對(duì)發(fā)光細(xì)菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其EC50值大小順序?yàn)?環(huán)丙沙星-阿奇霉素＞阿司匹林-阿奇霉素＞阿司匹林-環(huán)丙沙星。環(huán)丙沙星-阿奇霉素混合體系的聯(lián)合毒性最小;阿司匹林-環(huán)丙沙星混合體系對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性最大。三元混合體系(阿司匹林-環(huán)丙沙星-阿奇霉素)的EC50值小于二元混合體系(環(huán)丙沙星-阿奇霉素)的EC50值，即環(huán)丙沙星-阿奇霉素混合體系在加入阿司匹林以后，其EC50值有所減小。這種變化，體現(xiàn)了不同性質(zhì)的官能團(tuán)對(duì)聯(lián)合作用的不同影響。

2.3 聯(lián)合毒性作用類型分析

分別采用毒性單位法(TU)、相加指數(shù)法(AI)和混合毒性指數(shù)法(MTI)對(duì)混合體系的聯(lián)合毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，獲得了一致性的結(jié)果(見表3)，即阿司匹林-阿奇霉素和環(huán)丙沙星-阿奇霉素二元混合體系、阿司匹林-環(huán)丙沙星-阿奇霉素三元混合體系的聯(lián)合毒性作用類型均為拮抗作用;阿司匹林-環(huán)丙沙星二元混合體系的聯(lián)合毒性作用類型為部分相加。

表3 毒性單位法(TU)評(píng)價(jià)聯(lián)合毒性作用類型結(jié)果

2.4 聯(lián)合毒性作用評(píng)價(jià)方法靈敏度分析

為了較直觀的比較3種不同的聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法對(duì)某聯(lián)合體系的靈敏程度與適合程度，董玉瑛等應(yīng)用M0-M、AI、MTI-1數(shù)值大小代表協(xié)同作用的強(qiáng)度［8］。對(duì)表現(xiàn)為拮抗作用的3組聯(lián)合體系的評(píng)價(jià)指數(shù)作進(jìn)一步處理，認(rèn)為M-M0、-AI、1-MTI數(shù)值大小可以代表拮抗作用的強(qiáng)度。三元混合體系與其他兩種二元混合體系相比，其拮抗作用最強(qiáng)(如圖4)，同時(shí)顯示混合毒性指數(shù)法參數(shù)數(shù)值較大，判定其靈敏度較高，可作為該研究體系的推薦評(píng)價(jià)方法。

圖4 3種不同聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)方法的比較

2.5 聯(lián)合毒性作用機(jī)制初步探討

綜合分析二元及三元混合體系聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)結(jié)果可以看出，除了阿司匹林與環(huán)丙沙星混合體系的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為部分相加作用之外，其余的幾組混合體系均表現(xiàn)為拮抗作用。對(duì)于呈現(xiàn)的這些聯(lián)合作用類型，可從發(fā)光菌的發(fā)光原理、APIs的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和特殊藥效，進(jìn)行初步的聯(lián)合毒性機(jī)理分析。

在明亮發(fā)光桿菌的發(fā)光反應(yīng)中，F(xiàn)MNH2被氧化成FMN的過程中起到了傳遞氫的作用［9］。外源性污染物質(zhì)可干擾或損害細(xì)菌呼吸或生理過程，阻礙正常的發(fā)光反應(yīng)，影響傳遞氫的作用，致使發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光受到抑制。本文研究的聯(lián)合毒性產(chǎn)生拮抗作用的原因，可能是由于環(huán)丙沙星和阿奇霉素分子中均含有N元素，對(duì)于FMNH2分子而言是一種營養(yǎng)元素，可以一定程度上促進(jìn)FMNH2對(duì)氫的傳遞作用，進(jìn)而減弱單一物質(zhì)的阻礙作用，表現(xiàn)為拮抗作用。目前由于認(rèn)識(shí)水平、研究方法和技術(shù)上的限制，對(duì)于聯(lián)合作用機(jī)制尤其是多元混合體系的聯(lián)合作用機(jī)制的了解尚不夠充分。

3 結(jié)論

(1)阿司匹林、鹽酸環(huán)丙沙星和阿奇霉素3種常見醫(yī)藥品組成的二元和多元混合體系的毒性，除阿司匹林-環(huán)丙沙星二元混合體系的聯(lián)合毒性作用類型為部分相加，其他均表現(xiàn)為不同程度的拮抗作用。

(2)不同評(píng)價(jià)方法對(duì)二元和多元混合體系的協(xié)同強(qiáng)弱評(píng)價(jià)結(jié)果呈現(xiàn)出一致的順序，是聯(lián)合毒性評(píng)價(jià)的可行性方法。其中以混合毒性指數(shù)法的參數(shù)數(shù)值較大，判定靈敏度較高，為該研究體系的推薦評(píng)價(jià)方法。

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