大腸桿菌S12無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)合成AgrA蛋白的研究

瞿曉晶，權(quán)春善

(大連民族學(xué)院生物化學(xué)工程國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116605)

金黃色葡萄球菌隸屬于葡萄球菌屬，是革蘭氏陽(yáng)性菌［1］，可引起許多嚴(yán)重感染，是一種重要的致病菌。agr系統(tǒng)是雙組分信號(hào)系統(tǒng)［2］，能夠使該菌產(chǎn)生致病性并形成生物膜［3-4］。研究agr系統(tǒng)的調(diào)節(jié)原理，阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，將使新型抗生素研究得到重大突破。反應(yīng)調(diào)節(jié)子AgrA蛋白是agr系統(tǒng)的重要組成部分之一，其結(jié)構(gòu)和功能目前尚不清楚，其研究的瓶頸是可溶性表達(dá)量較低。無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)具有很多優(yōu)勢(shì)，如:反應(yīng)快速［5］，下游處理簡(jiǎn)單［6］，不受細(xì)胞制約，蛋白表達(dá)量高，無(wú)細(xì)胞毒性［7］，反應(yīng)靈活易調(diào)節(jié)。郭新娟等簡(jiǎn)化和優(yōu)化了大腸桿菌細(xì)胞抽提物的制備過(guò)程［8］，從而提高了細(xì)胞抽提物活性，并且優(yōu)化了大腸桿菌S12無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)。

本文利用無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)，表達(dá)了AgrA蛋白，為AgrA的功能研究和agr系統(tǒng)的機(jī)制研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。此外，溫度和時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響很大，因此本文考察了不同溫度和時(shí)間對(duì)無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)合成蛋白的影響。這些研究為agr系統(tǒng)的進(jìn)一步研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)于無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)的研究和應(yīng)用具有重要的借鑒意義，為金黃色葡萄球菌耐藥機(jī)制的研究和新型抗菌活性物質(zhì)的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

儀器:凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc-ItTM300 Moterized lens，USA);多任務(wù)梯度PCR儀(VeritiTM96-WELL Thermal Cycler，singapore，England);BTX電擊儀(EMC630，USA)等。

試劑:一抗 Anti-His(C-Term)mouse(全式金，北京);二抗 Rabbit-Anti-Mouse;EasySee Western Marker(全式金，北京);EasySee Western Blot Kit(全式金，北京);pIVEX2.3d質(zhì)粒載體(本實(shí)驗(yàn)室保存);質(zhì)粒 DNA小量提取試劑盒(BSC01M1，BioFlux);QIAprep Spin Miniprep Kit(27104，QIAGEN);其他試劑均為生化級(jí)，購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 體外表達(dá)載體的構(gòu)建

首先利用PCR方法從pPROEXHTa-agrA上擴(kuò)增目的片段agrA以構(gòu)建表達(dá)載體pIVEX2.3d-agrA。引物與目標(biāo)載體pIVEX2.3d具有～30 bps同源序列，與目的基因片段具有～20 bps同源序列。對(duì)PCR產(chǎn)物，即目的基因片段agrA，1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，切膠回收。將PCR產(chǎn)物作為大引物，與載體pIVEX2.3d進(jìn)行第二步PCR反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)目的基因插入到pIVEX2.3d載體之中。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物中包括空載體和插入目的基因的表達(dá)載體，采用DpnI消化法，消除母系空載體。消化反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行電轉(zhuǎn)，宿主細(xì)胞是E.coli.DH5α。涂布過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性單菌落，接菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，DNA測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 質(zhì)粒載體的提純與檢測(cè)

采用QIAprep Spin Miniprep Kit試劑盒(QIAGEN公司)提取質(zhì)粒:pIVEX 2.3d-agrA、pIVEX2.3d-GFP和 pIVEX2.3d-agrA-GFP。

1.2.3 大腸桿菌細(xì)胞抽提物的制備

(1)細(xì)胞培養(yǎng)。挑取E.coli BL21(DE3)codon-plus RIL單菌落于2×YT液體培養(yǎng)基中，次日以接種量5%接到2×YT培養(yǎng)基中，180 r·min-1，30℃培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)菌OD600達(dá)0.6時(shí)，加入終濃度為1 mM的IPTG。當(dāng)OD600≈3.0時(shí)，細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期，離心收菌，稱量濕重。

(2)在4℃下，每克收集的菌體用20 mL S30緩沖液 A重懸，離心收菌后浸液氮，保存于-70℃。

(3)在4℃下，每克細(xì)胞用1.27 mL S30緩沖液B溶解，解凍重懸。

(4)對(duì)菌體進(jìn)行高壓破碎，4℃下12 000×g離心10 min，取上清。

(5)簡(jiǎn)易空孵化。在37℃下將所得上清孵育30 min。

(6)分裝。浸液氮2 min后貯存于-70℃。

1.2.4 利用無(wú)細(xì)胞體系合成目的蛋白

在質(zhì)粒的濃度和純度都符合無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)的要求后，按照優(yōu)化的無(wú)細(xì)胞反應(yīng)體系，采用最簡(jiǎn)S12細(xì)胞抽提物，進(jìn)行AgrA、GFP、AgrA-GFP蛋白的合成。無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)在180 r·min-1，30℃條件下，避光反應(yīng)4 h(其中GFP表達(dá)條件需提供有氧環(huán)境)。按照優(yōu)化的無(wú)細(xì)胞反應(yīng)體系進(jìn)行AgrA蛋白的合成，GFP作為對(duì)照，反應(yīng)體系見表1。

表1 優(yōu)化的S12無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系組成

1.2.5 目的蛋白的檢測(cè)

無(wú)細(xì)胞反應(yīng)結(jié)束后，用丙酮處理反應(yīng)產(chǎn)物:取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物于無(wú)RNase的離心管中，加50 μL丙酮，置于冰上靜置5 min。隨后10 000 r·min-1離心5 min。棄上清，風(fēng)干20 min。用20 μL SDS-PAGE上樣緩沖液溶解沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

質(zhì)粒載體 pIVEX2.3d-agrA、pIVEX2.3d-GFP和pIVEX2.3d-agrA-GFP表達(dá)的蛋白在C端均帶有His標(biāo)簽，通過(guò)Western blot進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 體外表達(dá)載體的構(gòu)建

采用PCR方法擴(kuò)增目的片段agrA(776 bps)，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)得到的目的產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化，之后使其作為大引物，線性擴(kuò)增pIVEX2.3d目標(biāo)載體。結(jié)束后，進(jìn)行消化和電轉(zhuǎn)，得到pIVEX2.3d-agrA(4251 bps)質(zhì)粒載體(如圖1)，結(jié)果與預(yù)期相符。

圖1 質(zhì)粒pIVEX2.3d-agrA和pIVEX2.3d的電泳檢測(cè)圖

將得到的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果用DNAman軟件進(jìn)行分析，其中，基因比對(duì)結(jié)果為99%，相應(yīng)的蛋白質(zhì)比對(duì)結(jié)果為100%，得到的質(zhì)?？捎?。

2.2 AgrA蛋白的合成與檢測(cè)

在進(jìn)行無(wú)細(xì)胞蛋白合成反應(yīng)時(shí)，由于GFP蛋白肉眼便能觀察到明顯熒光，故在蛋白AgrA加上GFP標(biāo)簽，以便于對(duì)蛋白AgrA的合成進(jìn)行檢測(cè)。本文分別對(duì)蛋白AgrA、GFP、AgrA-GFP進(jìn)行合成反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，表達(dá)蛋白GFP和AgrA-GFP的試管便能肉眼明顯觀察到綠色熒光，AgrA和對(duì)照樣品試管觀察不到明顯的熒光。

對(duì)上述產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，觀測(cè)不到明顯的目的條帶。為了檢測(cè)蛋白的表達(dá)與否，對(duì)上述4組反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果如圖2。由圖2可見，加入質(zhì)粒模板的均有相應(yīng)的蛋白表達(dá)，未加入任何模板的體系(4號(hào))無(wú)蛋白表達(dá)。

圖2 無(wú)細(xì)胞反應(yīng)體系的Western blot檢測(cè)圖

從圖2看到，1號(hào)泳道對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物是蛋白AgrA-GFP(55.6 KD)。該泳道存在兩條帶，其中靠下的條帶比蛋白實(shí)際分子量小10 KDa左右;靠上的條帶與蛋白實(shí)際大小相符。有文獻(xiàn)報(bào)道:形成天然構(gòu)象的GFP融合蛋白的凝膠條帶會(huì)比正常分子量小10 KDa左右，而GFP融合蛋白若未形成天然構(gòu)象，其凝膠條帶會(huì)與其實(shí)際分子量大小相符［9］?？可系臈l帶可能是沒有正確折疊的AgrA-GFP融合蛋白;靠下的條帶是正確折疊的AgrA-GFP融合蛋白，大小比實(shí)際分子量小10 KDa左右。2號(hào)和3號(hào)泳道對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物分別是GFP(26.2 KDa)和AgrA蛋白(26.3 KDa)。該凝膠條帶與實(shí)際分子量大小相符?？梢?，在優(yōu)化的無(wú)細(xì)胞表達(dá)條件下，AgrA蛋白能夠得到有效表達(dá)。

2.3 不同反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)AgrA合成的影響

溫度和時(shí)間在無(wú)細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程中起著重要的作用。為了找到最佳的溫度和時(shí)間條件，在不同溫度、時(shí)間條件下，對(duì)AgrA和GFP蛋白進(jìn)行表達(dá)，其中GFP蛋白易于觀察，起對(duì)照作用，用于蛋白的定量。反應(yīng)結(jié)束后，GFP的熒光強(qiáng)度肉眼可以觀測(cè)，熒光強(qiáng)度從大到小依次為30℃、4 h，37 ℃、2 h，28 ℃、12 h，20 ℃、16 h，即在30 ℃、4 h條件下蛋白合成量最大。由western-blot檢測(cè)結(jié)果可知，在20℃、16 h條件下GFP蛋白表達(dá)量較低，沒有觀察到條帶，其他條件下均有清晰條帶，表明GFP表達(dá)(如圖3a)。AgrA的western-blot檢測(cè)結(jié)果如圖3b。由圖3b可見，不同條件下AgrA蛋白均有表達(dá)，其中20℃表達(dá)量比其他組稍低。綜合以上結(jié)果，最終確定30℃、4 h為最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間。

圖3 在不同溫度和時(shí)間條件下合成的AgrA和GFP蛋白的western blot檢測(cè)圖

3 結(jié)語(yǔ)

對(duì)蛋白的表達(dá)傳統(tǒng)方法是采用重組載體，在宿主菌體內(nèi)表達(dá)，此方法有多種缺點(diǎn):表達(dá)量低，細(xì)胞毒性大，易形成包涵體等。與體內(nèi)蛋白表達(dá)相比，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)克服了上述缺點(diǎn)，具有操作快速，高通量，表達(dá)量高和不形成包涵體等優(yōu)點(diǎn)。AgrA蛋白中的氨基酸含有半胱氨酸，在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中易形成二硫鍵，聚集在一起而形成包涵體，使蛋白不能正確折疊形成天然構(gòu)象并且沒有活性。為克服AgrA蛋白在胞內(nèi)表達(dá)的缺點(diǎn)，本文采用優(yōu)化的S12無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)合成AgrA蛋白。在AgrA蛋白的表達(dá)中，反應(yīng)溫度和時(shí)間起著重要的作用，其中溫度的高低會(huì)影響蛋白的翻譯和修飾，反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響酶的活性及反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在30℃、4 h條件下蛋白的表達(dá)效果較好。

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