6－BA和AgNO3對芥菜型油菜下胚軸芽再生的影響

袁玉輝，楊 柳，劉顯軍，陸 贏，劉忠松

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所/國家油料作物改良中心，長沙410128)

遺傳轉(zhuǎn)化能將外源基因?qū)肽康闹参铮z傳轉(zhuǎn)化的前提是高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。最常用的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，該系統(tǒng)有賴于受體的高效再生。油菜轉(zhuǎn)基因常用受體之一是下胚軸，由下胚軸誘導(dǎo)產(chǎn)生再生苗一般要經(jīng)歷誘導(dǎo)愈傷組織形成、愈傷組織分化成芽、誘導(dǎo)生根等步驟，其中誘導(dǎo)愈傷組織分化成芽不僅受植物基因型的影響，而且取決于培養(yǎng)基中激素種類及配比。6－BA是細(xì)胞分裂素，主要作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂和芽的形成［1］;AgNO3是乙烯抑制劑，Ag+使乙烯不能干擾多胺的合成。多胺合成有利于促進(jìn)體細(xì)胞胚的形成及再生芽的發(fā)生［2］，因此植物遺傳轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)芽再生的過程中常用到6－BA和AgNO3。

本研究以芥菜型油菜品種Brown mustard的下胚軸為外植體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過比較含不同濃度6－BA和AgNO3的分化培養(yǎng)基中芽再生情況，旨在探討不同濃度6－BA和AgNO3對芽再生的影響，以期為建立芥菜型油菜高頻再生體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

試驗(yàn)所用的根癌農(nóng)桿菌菌株是含雙元載體pBI121質(zhì)粒的GV3101。雙元載體pBI121含卡那霉素抗性基因NPTII和GUS基因。

1.1.2 植物材料

試驗(yàn)所用的芥菜型油菜品種為Brown mustard，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)孫萬倉教授提供，并經(jīng)多代自交純化。

1.2 方法

1.2.1 無菌外植體的獲取

挑選顆粒飽滿、無霉變的Brown mustard種子，無菌條件下，用75%酒精浸泡30 s，然后用0.1%升汞浸泡12 min，無菌水沖洗3～4次，無菌濾紙吸干多余的水分，接種于1/2 MS發(fā)芽培養(yǎng)基(添加20 g/L蔗糖，0.8%瓊脂，pH 5.8)中，暗培養(yǎng) 4 d，再光照培養(yǎng)2 d。所有外植體的培養(yǎng)溫度都為22+2℃，光強(qiáng)為2 000 lx，光周期為16(光)/8(暗)h。

下胚軸為6日齡，作為外植體被切成5～10 mm切斷，隨機(jī)平放于預(yù)培養(yǎng)基(MS+30 g/L蔗糖+0.8%瓊脂 +1 mg/L 2，4－D，pH 5.8)中預(yù)培養(yǎng)3 d，待下胚軸切口處剛開始膨大時(shí)用農(nóng)桿菌浸染。

1.2.2 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)

在含50 mg/L Rif(利福平)和50 mg/L Kan(卡那霉素)的YEP液體培養(yǎng)基的無菌三角瓶中培養(yǎng)農(nóng)桿菌的單克隆菌株，28℃，于180～200 rpm的搖床上振蕩暗培養(yǎng)24 h左右，直到農(nóng)桿菌菌液濃度(OD600)達(dá)到0.6左右時(shí)，離心棄上清收集菌體，用MS液重懸菌體，至菌液濃度(OD600)為0.3～0.6，添加100 mol/L AS(乙酰丁香酮)用于外植體的浸染。

1.2.3 外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)

在超凈工作臺上，將外植體浸漬在農(nóng)桿菌菌液中5 min，并不斷振蕩，倒去菌液，外植體收集于鋪有干燥無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，用濾紙去掉多余菌液，再將外植體接入共培養(yǎng)基(MS+30 g/L蔗糖+0.8%瓊脂 +1 mg/L 2，4 －D+1 mg/L AS，pH 5.8)中避光共培養(yǎng)2 d。

1.2.4 分化培養(yǎng)

用無菌水清洗共培養(yǎng)后的外植體3次，再用含500 mg/L羧芐青霉素(Cab)的MS液于搖床上輕微震蕩洗滌外植體30 min，防止農(nóng)桿菌過度生長，倒去液體，無菌濾紙吸干多余的水分，將外植體轉(zhuǎn)入含有不同濃度6－BA和AgNO3的MS分化培養(yǎng)基上(含有30 g/L蔗糖+0.8%瓊脂，pH 5.8)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.5 分化培養(yǎng)基中6－BA濃度處理

為了探究6－BA的濃度對芽再生的影響，將脫菌后的下胚軸轉(zhuǎn)移到含 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0 mg/L 7個(gè)濃度梯度的6－BA分化培養(yǎng)基中，每隔10 d繼代到相同的分化培養(yǎng)基中。分化培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，含有30 g/L蔗糖、0.8%瓊脂和500 mg/L Cab。每次處理20個(gè)下胚軸，重復(fù)3次。20 d后統(tǒng)計(jì)出芽率和芽叢數(shù)，取平均值(下同)。

1.2.6 分化培養(yǎng)基中硝酸銀濃度處理

為了研究AgNO3對芽再生的影響，在6－BA濃度處理試驗(yàn)篩選出出芽率最高的濃度(3 mg/L)基礎(chǔ)上，設(shè)置3、4、5、6 和7 mg/L 5 個(gè) AgNO3濃度梯度進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.7 6－BA和硝酸銀濃度配比處理

用出芽率最高的AgNO3濃度(5 mg/L)與前述的7個(gè)6－BA濃度梯度配比，比較分化培養(yǎng)基中加硝酸銀與不加硝酸銀的差別。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每次處理20個(gè)下胚軸，重復(fù)3次。20 d后統(tǒng)計(jì)出芽率和芽叢數(shù)，取平均值。出芽率和芽叢數(shù)計(jì)算方法如下:出芽率(%)=(再生不定芽的外植體數(shù)/外植體總數(shù))×100;芽叢數(shù)=(再生的不定芽總數(shù)/外植體總數(shù))×100。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)主要運(yùn)用Microsoft Excel 2003和DPS進(jìn)行處理，其中DPS中采用Duncan多重比較，取0.05顯著水平和0.01極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 6－BA濃度對芽再生的影響

下胚軸在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d左右后切口處開始膨大，長出黃綠色顆粒狀的愈傷組織。隨著愈傷組織的生長，10 d后綠色的不定芽(圖1:A1～A3)開始形成并生長。

圖1 芥菜型油菜品種Brown mustard下胚軸芽再生過程及再生芽芽叢形態(tài)Fig.1 The process and morphology of shoot regeneration from hypocotyls of Brown mustard(Brassica juncea L.)

分化培養(yǎng)基中6－BA濃度在3 mg/L以下時(shí)，外植體出芽率隨著6－BA濃度的增加而增加;當(dāng)6－BA的濃度為3 mg/L時(shí)出芽率最高，達(dá)41.67%，平均芽叢數(shù)為2.22。6－BA濃度達(dá)到3 mg/L以上時(shí)，外植體出芽率不僅不增加，反而隨著6－BA濃度增加而下降(表1)。而芽叢數(shù)在6－BA濃度為2.5 mg/L時(shí)達(dá)到最高值(2.96)，在2.0 mg/L時(shí)芽叢最少(1.71)，其余濃度的芽叢數(shù)都在2.11到2.60之間，有顯著差異，但隨濃度的升高芽叢數(shù)變化不一致。

表1 不同濃度6－BA的分化培養(yǎng)基中芽再生情況Table 1 The shoot regeneration in differentiation medium of different concentration 6－BA

2.2 AgNO3濃度對芽再生的影響

結(jié)果表明，在含3 mg/L6－BA的分化培養(yǎng)基中再添加AgNO3可促進(jìn)愈傷組織再生芽(表2)。當(dāng)AgNO3濃度在5 mg/L以下時(shí)，出芽率隨著AgNO3濃度的增加而增加;但AgNO3濃度在5 mg/L以上時(shí)，出芽率則隨濃度增加而下降，且嚴(yán)重玻璃化;在AgNO3濃度為 5 mg/L時(shí)出芽率最高，達(dá)到58.33%，比不加AgNO3時(shí)提高了40.00%，但芽叢數(shù)減少到1.73個(gè)，因而認(rèn)為分化培養(yǎng)基中以添加5 mg/L AgNO3效果最佳。

表2 不同濃度AgNO3的分化培養(yǎng)基中芽再生情況Table 2 The shoot regeneration in differentiation medium of different concentration AgNO3

2.3 6－BA和AgNO3配比對芽再生的影響

比較分化培養(yǎng)基中添加5 mg/L AgNO3和不加AgNO3出芽率和芽叢數(shù)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)3 mg/L 6－BA+5 mg/L AgNO3組合與其他組合差異顯著，出芽率最高，達(dá)到58.33%，進(jìn)一步表明分化培養(yǎng)基中添加3 mg/L 6－BA+5 mg/L AgNO3最有利于芽分化(表1)。

3 討論

植物離體組織培養(yǎng)中，不定芽再生頻率與植物基因型、外植體類型及生理狀態(tài)、生長調(diào)節(jié)劑等因素有關(guān)［3］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低濃度6－BA對芥菜型油菜Brown mustard不定芽分化和生長有促進(jìn)作用，但濃度過高卻表現(xiàn)為抑制作用，與何小蘭等對甘藍(lán)型油菜的研究結(jié)果一致，可能與內(nèi)外源激素達(dá)到特定平衡狀態(tài)和激素受體存在飽和狀態(tài)有關(guān)，即6－BA濃度過高會(huì)對不定芽產(chǎn)生一定的毒害性［4］，其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

AgNO3的添加可明顯提高芥菜型油菜Brown mustard下胚軸芽再生頻率，使芽分化提早，這與唐桂香等［5］、Akasaka － Kennedy 等［6］、Khan 等［7］和李會(huì)珍等［8］對甘藍(lán)型油菜和胥宇建等［9］對大白菜的研究結(jié)果一致。不同濃度的AgNO3對出芽率的影響有差異，當(dāng)分化培養(yǎng)基中含有5 mg/L AgNO3時(shí)最有利于芥菜型油菜Brown mustard下胚軸的芽再生。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)在相同的激素配比下，隨著Ag-NO3濃度的進(jìn)一步升高，出芽率反而下降，表現(xiàn)出一定的副作用，這與胥宇建的報(bào)道一致［9］。

培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑的組成和配比對不定芽的再生頻率也有著重要的影響，不同基因型和外植體對生長調(diào)節(jié)劑的反應(yīng)不同。本研究以含3 mg/L 6－BA+5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基最適合芥菜型油菜品種Brown mustard下胚軸的芽再生。Maheshwari等［10］的研究表明，培養(yǎng)基中含5 mg/L 6－BA+5 mg/L AgNO3利于甘藍(lán)型油菜下胚軸的芽再生。而曹必好等［11］、Kong 等［12］對甘藍(lán)型油菜和Xiang等［13］對大白菜的試驗(yàn)表明，添加適量的NAA更有利于不定芽的再生。但我們以前的研究表明，一旦添加NAA就伴隨著大量根毛的生成，嚴(yán)重影響芽分化，這與湯敏等［14］的研究一致，這可能與植物基因型、外植體類型不同有關(guān)。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化效率受植物基因型、外植體種類、浸染濃度與時(shí)間、培養(yǎng)基等多重因素影響［16］。對于不同基因型、浸染濃度與時(shí)間、愈傷誘導(dǎo)和誘導(dǎo)生根等關(guān)鍵步驟中最適激素配比對芥菜型油菜轉(zhuǎn)化的影響還有待進(jìn)一步研究。

［1］ 何雍琴，遲淑娟，楊正安，等.不同濃度6－BA和Ag-NO3對甘藍(lán)葉片不定芽分化的影響［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，26:345 －347，363.

［2］ 張 鵬，凌定厚.提高菜心離體植株再生頻率的研究［J］.植物學(xué)報(bào)，1995，37(11):902 －908.

［3］ Khehra GS，Mathias RJ.The interaction of genotype，explant and media on the regeneration of shoots from complex explants of Brassica napus L［J］.Journal of Experimental Botany，1992，43:1413 －1418.

［4］ 何小蘭，吳敬音，朱衛(wèi)民.6－BA和AgNO3對甘藍(lán)型油菜帶柄子葉外植體不定芽再生的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2001，17(4):211 －214.

［5］ 唐桂香，周偉軍.AgNO3對甘藍(lán)型油菜子葉外植體植株再生的影響［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，2001，23(3):9－12.

［6］ Yoko Akasaka － Kennedy，Hidefumi Yoshida，Yoshihito Takahata.Efficient plant regeneration from leaves of rapeseed(Brassica napus L.):the influence of AgNO3and genotype［J］.Plant Cell Rep，2005，24:649 －654.

［7］ Muhammad Ramzan Khan，Hamid Rashid，Muhammad Ansar.High frequency shoot regeneration and Agrobacterium－mediated DNA transfer in Canola(Brassica napus)［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2003，75:223－231.

［8］ 李會(huì)珍，張志軍，周偉軍.基因型和AgNO3對甘藍(lán)型油菜子葉外植體植株再生的影響［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，2003，25:20–22.

［9］ 胥宇建，孟 箭，張魯剛，等.不同激素配比和AgNO3對兩種基因型大白菜子葉離體再生的影響［J］.植物生理學(xué)通訊，2010，46(6):564 －570.

［10］ Maheshwari P，Selvaraj G，Kovalchuk I.Optimization of Brassica napus(canola)explant regeneration for genetic transformation［J］.New Biotechnology，2011，29:144 －155.

［11］ 曹必好，雷建軍，宋洪元，等.芥菜農(nóng)桿菌高效遺傳轉(zhuǎn)化體系初步建立［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24(4):48－51.

［12］ Kong F，Li J，Tan X，et al.A new time－saving transformation system for Brassica napus［J］.Afr J Biotechnol，2009，8:2497 －2502.

［13］ Xiang Y，Wong WKR，Ma MC，et al.Agrobacterium －mediated transformation of Brassica campestris ssp.Parachinensis with synthetic Bacillus thuringiensis cry1Ab and cry1Ac genes［J］.Plant Cell Rep，2000，19:251－256.

［14］ 湯 敏，官春云，劉忠松.油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系研究進(jìn)展［J］.作物研究，2012，26(3):295 －298，313.

［15］ 楊 柳，劉忠松.油菜農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系研究進(jìn)展［J］.作物研究，2007，21(5):650 －653.

［16］ Tsukazaki H，Kuginuki Y，Aida R，et al.Agrobacterium－mediated transformation of a doubled haploid line of cabbage［J］.Plant Cell Rep，2002，21:257 －262.