水稻抗稻瘟病分子遺傳研究進(jìn)展

鄭卓之，李 魏，戴良英*

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128;2作物基因工程湖南省重點(diǎn)實驗室，長沙410128)

稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe oryzae引起的一種真菌性病害，在水稻的整個生育階段皆可發(fā)生，是嚴(yán)重影響水稻生產(chǎn)的最主要病害之一。稻瘟病分布極廣，世界上主要水稻種植區(qū)均有發(fā)生，如何防治稻瘟病早已成為世界性的重點(diǎn)研究課題。自上世紀(jì)中葉至今，關(guān)于稻瘟病的研究取得了許多突出成果，培育含有抗稻瘟基因的水稻品種成為防治稻瘟病的重要手段。由于稻瘟菌生理小種變異過快，各地稻瘟菌生理小種各異，水稻生長環(huán)境也差異較大，因此只含有單一抗稻瘟病基因的水稻品種很難持久、穩(wěn)定地表現(xiàn)出稻瘟病抗性。所以，將廣譜抗稻瘟病基因或者多個抗稻瘟病基因?qū)氲揭粋€水稻品種中，使之具有廣譜而且持久的稻瘟病抗性成為水稻抗病育種研究的重要方向。

Harold H.Flor于20世紀(jì)早期提出了“基因?qū)颉奔僬f［1］，植物抗性基因編碼的蛋白能與病原物無毒基因所編碼的蛋白相互作用，進(jìn)而引起植物的抗病反應(yīng)。研究表明，水稻抗性基因與稻瘟病無毒基因的蛋白特異性相互作用符合“基因?qū)颉奔僬f，所以對稻瘟菌無毒基因與水稻抗稻瘟菌基因的相互作用的研究，可以為水稻抗病育種中抗病基因的合理選擇提供研究基礎(chǔ)。同時，對于不同地區(qū)、不同環(huán)境選擇何種水稻抗稻瘟病品種提供理論依據(jù)。

1 水稻抗稻瘟病基因的定位和克隆

迄今為止，已報道了水稻中至少85個主效抗稻瘟病基因，其中已克隆基因22個(表1)。這些主效抗稻瘟病基因成簇分布在水稻基因組除3號染色體以外的其他11條染色體上。其中以6號、11號和12號染色體分布的數(shù)量最多，分別為15、22和16個(http://www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm，2012－06－20)。Monosi等通過分析水稻基因組，發(fā)現(xiàn)水稻中約有500個基因含NBS－LRR結(jié)構(gòu)，其中位于11號染色體的約占25%［2］。

表1 已克隆的水稻抗稻瘟基因分子定位及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)Table 1 Cloned rice blast resistance genes molecular localization and structure characteristics

2 水稻抗稻瘟病基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

通過對比所有植物中已克隆的70多個抗性基因，在一些結(jié)構(gòu)域上它們表現(xiàn)出高度保守性和同源性。這些保守的功能性結(jié)構(gòu)域包括:核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS結(jié)構(gòu)域)、富含亮氨酸重復(fù)(LRR結(jié)構(gòu)域)、Toll蛋白和白細(xì)胞介素1受體(TIR結(jié)構(gòu)域)、無規(guī)則卷曲(CC結(jié)構(gòu)域)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)、激酶(KIN)、亮氨酸拉鏈(LZ)等。植物抗性基因根據(jù)這些保守結(jié)構(gòu)域大致可分為4類［3］:NBS－LRR類型、KIN類型、TM－LRR類型和TM－CC類型。也有少數(shù)已克隆的植物抗性基因不屬于以上4類，如第一個克隆的植物抗性基因Hm1，它編碼一個HC－毒素還原酶［4］。

NBS－LRR結(jié)構(gòu)域中，N端NBS結(jié)構(gòu)是最為保守的部分，能與核苷酸結(jié)合并參與調(diào)控細(xì)胞死亡，從而使植物表現(xiàn)出抗病反應(yīng)［5］。C端的LRR結(jié)構(gòu)域是一段多亮氨酸重復(fù)出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。LRR結(jié)構(gòu)域能識別病原物無毒基因產(chǎn)物，引發(fā)抗性反應(yīng)的產(chǎn)生［6］，是抗病專化性的基礎(chǔ)［7］。例如，在 Pita/Avr－Pita的直接互作中，Pita表達(dá)產(chǎn)物與Avr－Pita表達(dá)產(chǎn)物的特異性結(jié)合與LRR區(qū)域有關(guān)［8］。植物在長時間與病原物共同進(jìn)化后使得不同基因中的LRR區(qū)域具有明顯的差異。NBS－LRR類型抗性基因在已克隆的70多個植物抗性基因中是最多的一種，占70%左右［9］。在已克隆的22個水稻抗稻瘟病基因中，除Pi21含重金屬結(jié)合域(heavy mental－associated domain)和富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域(proline－rich region)［10］，Pid －2 編碼凝集素受體激酶(Receptor kinase/B lectin)外［11］，其他抗稻瘟病基因均屬于NBS－LRR類型(表1)。

3 稻瘟病Avr基因的鑒定和克隆

病原物Avr基因編碼的蛋白能直接或間接地被寄主植物體內(nèi)相應(yīng)的R蛋白特異性識別并激活植物的抗病反應(yīng)。近年來，對于真菌Avr基因的鑒定取得了較大的進(jìn)展，為研究R基因與Avr基因的相互作用、共同進(jìn)化以及植物抗病機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

至今已有40多個稻瘟病Avr基因被鑒定，其中9 個已被克隆:Pwl1、Pwl2、Avr － CO39、Avr－ Pita、ACE1、AvrPiz － t、Avr － Pia、Avr － Pii和 Avr －Pik/km/kp(表2)。已經(jīng)成對克隆出Avr基因和R基因的有:Avr－Pita與Pita，AvrPiz－t與Piz－t，Avr－Pia與Pia，以及Avr－Pik/km/kp與Pik/Pikm/Pik－p(表2)。此外，通過序列比對和遺傳關(guān)聯(lián)分析，鑒定了AvrPia、AvrPii和AvrPik/km/kp 3個無毒基因［12，13］。其中，AvrPii所編碼的蛋白包含典型的鋅指結(jié)構(gòu)和 LXAR結(jié)構(gòu)［13］，前者是一種通過與DNA結(jié)合進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)的保守結(jié)構(gòu)域。另外一個已克隆的Avr基因ACE1編碼一個含4 035個氨基酸的蛋白，該蛋白是已克隆的9個稻瘟病無毒基因中唯一一個非分泌蛋白(表2)。ACE1的N－端含有I型聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)，C－端則含與細(xì)菌非核糖體多肽合成酶(non－ribosomal peptide synthetases，NRPS)同源的特殊無毒結(jié)構(gòu)［14］。該蛋白是一種聚酮化合物的生物合成中的關(guān)鍵調(diào)控因子［14］。有趣的是，ACE1只在成功侵染水稻葉片的稻瘟病成熟附著胞中表達(dá)。ACE1與其在水稻中對應(yīng)的R基因Pi33并不是直接相互作用，而是ACE1在附著胞侵染過程中引發(fā)了Pi33介導(dǎo)的抗病反應(yīng)［14］。Li等成功地從稻瘟病無毒菌株81278ZB15中分離到了Avr基因AvrPiz－t［15］。通過生物信息學(xué)手段分析表明，AvrPiz－t編碼長度為108個氨基酸的分泌蛋白，但在其他真菌中卻找不到同源的蛋白。測序分析發(fā)現(xiàn)毒性親本Guy11菌株中的AvrPiz－t起始密碼子上游462 bp處有一個Pot3轉(zhuǎn)座子插入導(dǎo)致AvrPiz－t無毒功能的喪失。啟動子功能驗證實驗表明，Pot3在位于起始密碼子上游537 bp和736 bp處插入并不影響該菌株的無毒性，因而只有保證起始密碼子上游大于462 bp的區(qū)域工作正常時，AvrPiz－t才能夠發(fā)揮其無毒基因的功能［15］。AvrPiz－t表達(dá)產(chǎn)物在煙草葉片中能夠抑制BAX誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡，證明了AvrPiz－t對稻瘟病的侵染致病有一定的作用［15］。

表2 已克隆的稻瘟菌無毒基因Table 2 Cloned Magnaporthe oryzae avirulence genes

4 水稻抗稻瘟病基因與稻瘟病Avr基因的互作機(jī)制

目前研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物R基因與病原菌Avr基因所編碼的蛋白并不能直接互作而是R蛋白通過寄主體內(nèi)的輔助蛋白與Avr蛋白間接互作，即“保衛(wèi)”模式(Guard Model)。例如病原細(xì)菌Pseudomonas syringae分泌的效應(yīng)蛋白 AvrRpm1、AvrB和AvrRpt2只有在磷酸化或水解輔助蛋白RIN4后才能引起相應(yīng)R蛋白RPM1和RPS2介導(dǎo)的抗病反應(yīng)。在已定位和克隆的稻瘟病抗性基因中存在一些廣譜抗性基因，如Pi1、Pi2、Pi－gm和Pihk1等。這種無毒蛋白對輔助蛋白RIN4修飾后的間接作用模式，可用以解釋一種抗性蛋白識別多種無毒蛋白出現(xiàn)廣譜抗性的原因。

除了間接作用外，植物R蛋白與病原菌Avr蛋白還有一種方式是直接相互作用。例如，水稻中抗稻瘟病R蛋白Pita與稻瘟病Avr蛋白Avr－Pita，Pik與Avr－Pik都屬于直接作用。Avr－Pita C末端具的176個氨基酸(Avr－Pita176)包含一個金屬蛋白酶功能域。Avr－Pita176能與Pita的LRR區(qū)域特異性結(jié)合，引發(fā)植物的抗病反應(yīng)［8］。Pi－ta與其同源感病基因編碼產(chǎn)物的區(qū)別僅僅是在第918個氨基酸由丙氨酸置換成絲氨酸［19］。Avr－Pita176或者Pita的LRR區(qū)域中任意一個氨基酸的改變都會破壞Avr－Pita與Pita的相互作用，從而使植物失去對稻瘟病的抗性［8］。Pik及其等位基因中都含有2個NBS－LRR基因，只有在2個NBS－LRR基因都存在的情況下才表現(xiàn)出抗病反應(yīng)［20］。不同的Pik等位基因與對應(yīng)的不同Avr－Pik基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠特異性結(jié)合，它們的結(jié)合方式與Pita不同，不是與LRR結(jié)構(gòu)域有關(guān)而是與Pik－1的N－端的CC結(jié)構(gòu)域相關(guān)。此外，需要2個NBS－LRR基因才能介導(dǎo)對同一個稻瘟病菌株抗性的還有 Pi5和Pia［22－23］。

對于稻瘟病菌來說最簡單地避免被水稻R基因識別的方法就是失去Avr基因。Avr－Pia和Avr－Pii似乎采取的就是這種方式避免被水稻R基因識別，因為在對已克隆的Avr基因的DNA多態(tài)性分析中，Avr－Pia和Avr－Pii僅表現(xiàn)出存在缺失性多態(tài)［21］。然而在稻瘟病菌與水稻的協(xié)同進(jìn)化過程中，帶有Avr－Pik的稻瘟病菌株并不是通過失去Avr－Pik避免R基因的識別，而是通過氨基酸的置換形成不同的等位基因。那么有可能Avr－Pik的缺失比Avr－Pia和Avr－Pii的缺失對稻瘟菌而言有著更大的影響。要明白Avr基因在稻瘟病侵染過程中起到什么作用，就需要在其對應(yīng)R基因缺失的情況下分析確認(rèn)其與寄主植物的哪一個或幾個靶標(biāo)蛋白起作用。

5 展望

植物不像動物一樣具有完善的獲得性免疫系統(tǒng)，所以對于病原物的抗性只能通過抗性基因的表達(dá)來完成。雖然對于水稻抗性基因的研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，但是由于稻瘟病菌致病小種的易變性和多態(tài)性，水稻生產(chǎn)依然受到較大威脅。定位、克隆更多廣譜、穩(wěn)定的稻瘟病R基因?qū)τ谒究共∮N具有重要意義。但是從長遠(yuǎn)來看，由于稻瘟病菌極強(qiáng)的適應(yīng)能力和較快的小種變異速度，水稻R基因很難保持穩(wěn)定、持續(xù)的抗性。所以，有必要對水稻R基因與稻瘟病菌Avr基因的互作機(jī)制進(jìn)行更深入的研究，理解R基因與Avr基因的識別方式、水稻內(nèi)在抗性機(jī)制以及水稻R基因與稻瘟病菌Avr基因的共同進(jìn)化規(guī)律，找出能廣譜、持續(xù)、穩(wěn)定提高水稻對稻瘟病抗性的方法。

［1］ Flor HH.Complementary genetic systems in flax and flax of recombination values in heredity ［J］.Adv Genet，1956，8:29－54.

［2］ Monosi B，Wisser RJ，Pennill L，et al.Full－genome analysis of resistance gene homologues in rice［J］.Theoretical and Applied Genetics，2004，109:1434－1447.

［3］ Martin GB，Bogdanove AJ，Sessa G.Understanding the functions of plant disease resistance proteins［J］.Annu Rev Plant Bio，2003，154:23－61.

［4］ Johal GS，Briggs SP.Reduetase activity encoded by the HM1 disease resistance gene in maize ［J］.Science，1992，258:985－987.

［5］ Traut TW.The function and consensus motifs of nine types of peptide segments that form different types of nucleiotide － binding sites［J］.Eur J Biochem，1994，222:9－19.

［6］ Ronald PC.The molecular basis of disease resistance in rice［J］.Planr Mol Biol，1997，35:179 －186.

［7］ Hulbert SH，Webb CA，Smith SM，et al.Resistance gene complexes:evolution and utilization［J］.Annu Rev Phyropatho，2001，139:285－312.

［8］ Jia Y，McAdams SA，Bryan GT，et al.Direct interaction of resistance gene and avirulence gene products confers rice blast resistance［J］.EMBO J，2000，19:4004 －4014.

［9］ Liu Jinling，Liu Xionglun，Dai Liangying，et al.Recent progress in elucidating the structure.Function and evolution of disease resistance genes in plant［J］.Journal of Genetics and Genomics，2007，34:765－776.

［10］ Fukuoka S，Saka N，Koga H，et al.Loss of function of a proline－containing protein confers durable disease resistance in rice［J］.Science，2009，325:998 －1001.

［11］ Chen XW，Shang JJ，Chen DX，et al.A B－lectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance［J］.The Plant Journal，2006，46(5):794 －804.

［12］ Miki S，Matsui K，Kito H，et al.Molecular cloning and characterization of the AVR－Pia locus from a Japanese field isolate of Magnaporthe oryzae ［J］. Mol Plant Pathol，2009，10:361 －374.

［13］ Yoshida K，Saitoh H，F(xiàn)ujisawa S，et al.Association genetics reveals three novel avirulence genes from the rice blast fungal pathogen Magnaporthe oryzae ［J］.Plant Cell，2009，21:1573 －1591.

［14］ Bhnert HU，F(xiàn)udal I，Dioh W，et al.A putative polyketide synthase/peptide synthetase from Magnaporthe grisea signals pathogen attack to resistant rice［J］.Plant Cell，2004，16:2499 －2513.

［15］ Li W，Wang B，Wu J，et al.The Magnaporthe oryzae avirulence gene AvrPiz－t encodes a predicted secreted protein that triggers the immunity in rice mediated by the blast resistance gene Piz－ t［J］.Mol Plant－ Microbe Interact，2009，22:411 －420.

［16］ Sweigard JA，Carroll AM，Kang S，et al.Identification，cloning，and characterization of PWL2，a gene for host species specificity in the rice blast fungus［J］.Plant Cell，1995，7:1221－1233.

［17］ 張紅生，吳云雨，鮑永美，等.水稻與稻瘟病菌互作機(jī)制研究進(jìn)展［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，35:1－8.

［18］Leong SA.The ins and outs of host recognition of Magnaporthe oryzae［C］.Genomics of Disease，2008:199 －216.

［19］ Bryan GT，Wu KS，F(xiàn)arrall L，et al.A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi － ta ［J］.Plant Cell，2000，12:2033－2046.

［20］ Ashikawa I，Hayashi N，Abe F，et al.Characterization of the rice blast resistance gene Pik cloned from Kanto51［J］.Mol Breeding，2012，30:485 －494.

［21］ Kanzaki H，Yoshida K，Saitoh H，et al.Arms race coevolution of Magnaporthe oryzae AVR－Pik and rice Pik genes driven by their physical interactions［J］.The Plant Journal，2012，72:894 －907.

［22］ Lee SK，Song MY，Seo YS，et al.Rice Pi5－mediated resistance to Magnaporthe oryzae requires the presence of two coiled－coil－nucleotide－binding－leucine－rich repeat genes［J］.Genetics，2009，181:1627 －1638.

［23］ Okuyama Y，Kanzaki H，Abe A，et al.A multifaceted genomics approach allows the isolation of the rice Piablast resistance gene consisting of two adjacent NBSLRR protein genes［J］.Plant J，2011，66:467 －479.