小陷胸湯對動脈粥樣硬化大鼠血清炎癥因子水平及主動脈內(nèi)膜厚度的影響＊

孫勤國 呂 琨

1武漢市第三醫(yī)院中醫(yī)科，武漢 430060

2湖北中醫(yī)藥大學，武漢 430065

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一組稱為動脈硬化的血管病中最常見、最重要的一種，其特點是動脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小[1]。在AS病理機制的認識上，1999年Ross[2]在內(nèi)皮損傷反應學說基礎上提出，AS是一種炎癥性疾病。炎癥反應貫穿于AS起始、病變進展、斑塊破裂及血栓形成的全過程[3]。因此，針對炎癥機制有望尋找到抗動脈硬化的新靶點與治療手段[4]。本實驗通過高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射維生素D3建立AS大鼠模型，觀察小陷胸湯對AS大鼠主動脈病理形態(tài)學、炎性因子及主動脈內(nèi)膜厚度的影響，探討其抗AS的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康SPF級雄性Wistar大鼠60只，體重（210±20）g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號：0018633，飼養(yǎng)于安靜、潔凈、避強光的環(huán)境中，室溫（20±5）℃，相對濕度40%～60%。

1.2 藥物與試劑

小陷胸湯出自《傷寒論》，由黃連6g，半夏12g，栝樓實30g組成。以上藥材均由本院中藥房提供，中藥炮制室用傳統(tǒng)方法浸泡，煎煮，過濾，濃縮，制成煎劑，其中小、中、大劑量每毫升含生藥分別為0.21、0.42、0.84g，真空包裝，低溫冷藏備用。阿托伐他?。⑵胀祝?0mg／片，購自美國輝瑞制藥有限公司（批號：J20030047）。維生素D3注射液購自上海通用藥業(yè)股份有限公司（批號：H31021404）。大鼠白介素－6（IL－6）、氧化型低密度脂蛋白（ox－LDL）、血管細胞黏附分子－1（VCAM－1）的ELISA試劑盒購自上海瑞齊生物科技公司。急性期反應蛋白（CRP）試劑盒購自上海科華生物工程股份有限公司。

1.3 動物分組及造模

適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分成6組：正常組、模型組、阿托伐他汀組及小陷胸湯低、中、高劑量組，每組10只。正常組進食基礎飼料（53.0%碳水化合物、9.0%脂肪、21.0%蛋白質(zhì)）。其余各組在喂食高脂飼料（3.0%膽固醇、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、10.0%豬油、5.0%白糖、81.3%基礎飼料）的同時，在進食高脂飼料第1天，一次性腹腔注射維生素D360萬IU／kg[3]，正常組注射同等體積的生理鹽水。

造模第3周開始，根據(jù)人與大鼠體表面積換算法，小陷胸湯低、中、高劑量組大鼠分別灌胃小陷胸湯小劑量、中劑量、大劑量煎劑（按2ml／200g計算），1次／d。阿托伐他汀組給予阿托伐他汀5mg／kg水溶液灌胃，1次／d。正常組及模型組則分別灌服等容積的生理鹽水。各組均連續(xù)灌胃12周。

1.4 血清學檢測指標

末次給藥后，隔夜禁食12h，腹主動脈采血，3 000 r／min離心10min，分離血清。采用ELISA法檢測血清IL－6、ox－LDL、VCAM－1濃度，采用免疫比濁法測定血清CRP水平。

1.5 動脈內(nèi)膜厚度的測定

取3.0cm左右長的主動脈血管，剝離外膜附著組織，制作冰凍切片，然后進行油紅O染色，步驟如下：將冷凍切片常溫干燥25min后，60%異丙醇浸洗10min，油紅O染液染色10min，用60%異丙醇漂洗除去多余染料，Mayer蘇木精復染1min，自來水藍化1～3min，蒸餾水洗，濾紙吸干水分，甘油明膠封片。光鏡下觀察其病理形態(tài)，組織細胞中脂滴呈橘紅色，核呈藍色。應用計算機圖像分析系統(tǒng)（motic images advanced 3.0圖像分析軟件）測主動脈內(nèi)膜厚度，每片隨機取3個視野，取其平均值。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清炎性因子水平

與正常組比較，模型組大鼠血清IL－6、ox－LDL、VCAM－1、CRP水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，小陷胸湯各劑量組及阿托伐他汀組大鼠血清IL－6、ox－LDL、VCAM－1、CRP 水平明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清炎性因子水平的比較（n＝10，±s）

表1 各組大鼠血清炎性因子水平的比較（n＝10，±s）

與正常組比較＊＊P＜0.01；與模型組比較△△P＜0.01

組別 IL－6（ng／L） ox－LDL（mmol／L） VCAM－1（pg／ml） CRP（mg／L）96.25±13.65 4.38±1.47 0.78±1.91 0.50±0.67模型組 406.46±23.15＊＊ 17.84±3.38＊＊ 5.67±3.03＊＊ 4.52±0.18＊＊小陷胸湯低劑量組 253.75±16.45△△ 9.85±2.41△△ 2.13±2.05△△ 1.84±0.41△△小陷胸湯中劑量組 158.75±15.97△△ 9.65±1.45△△ 1.65±1.76△△ 0.77±0.73△△小陷胸湯高劑量組 161.46±18.55△△ 10.12±2.07△△ 1.84±2.26△△ 1.76±0.77△△阿托伐他汀組 325.21±20.36△△ 15.74±2.31△△ 3.71±2.54△△ 2.45±0.21正常組△△

2.2 各組大鼠主動脈內(nèi)膜厚度

與正常組比較，模型組內(nèi)膜厚度顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組內(nèi)膜厚度明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

2.3 各組大鼠主動脈病理形態(tài)學

正常組大鼠主動脈內(nèi)膜表面光滑，內(nèi)膜無脂質(zhì)沉積，未見異常改變；模型組大鼠主動脈內(nèi)膜明顯增厚，可見大量紅色脂質(zhì)沉積，油紅O染色陽性區(qū)呈片狀；各治療組大鼠血管腔內(nèi)亦可見紅色脂質(zhì)沉積，但較對照組呈不同程度減輕。見圖1。

表2 各組大鼠主動脈內(nèi)膜厚度的比較（n＝10，mm，±s）

表2 各組大鼠主動脈內(nèi)膜厚度的比較（n＝10，mm，±s）

與正常組比較＊＊P＜0.01；與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01

1.77±0.43模型組 18.18±2.23＊＊小陷胸湯低劑量組 14.79±1.93△小陷胸湯中劑量組 6.21±1.35△△小陷胸湯高劑量組 8.98±0.65△△阿托伐他汀組 3.78±0.66組別 主動脈內(nèi)膜厚度正常組△△

圖1 各組大鼠主動脈病理形態(tài)學（油紅O染色，×400）

3 討論

AS主要累及大中動脈，其基本病變是在動脈內(nèi)膜形成粥樣斑塊，使動脈壁變硬，管腔狹窄，從而引起一系列繼發(fā)性病變[1]，因其常并發(fā)心、腦血管意外事件而占疾病病死率的首位。越來越多的研究[5－10]表明，AS是一種慢性、亞臨床的炎癥性疾病，疾病的發(fā)生進展都和炎癥相關，與炎癥反應相關的IL－6、ox－LDL、VCAM－1、CRP在AS的形成和發(fā)展中起到重要作用。

小陷胸湯由黃連、半夏、栝蔞實三味藥組成，方出《傷寒論》，具有清熱化痰，消痞散結之功效，臨床上該方加減后廣泛用于心血管類疾病的治療。左建國[11]用加味小陷胸湯聯(lián)合辛伐他汀治療高脂血癥42例，結果總有效率為95.2%。劉遠婷等[12]用小陷胸湯聯(lián)合丹參飲治療痰瘀閉阻型冠心病心絞痛患者30例，取得了較好療效。李景君等[13]用加味小陷胸湯治療不穩(wěn)定型心絞痛，選擇符合診斷標準的不穩(wěn)定型心絞痛患者30例，結果總有效率90.0%。

本研究采用高脂飼料配合維生素D3腹腔注射，復制AS大鼠模型，可觀察到脂質(zhì)斑塊形成，主動脈內(nèi)膜明顯增厚。該方法價格低廉，且能快速建立AS模型，是目前研究AS應用最為廣泛的模型建立方法之一[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組血清 IL－6、ox－LDL、VCAM－1、CRP水平明顯高于正常組，提示上述炎性介質(zhì)與AS的形成密切相關，與目前眾多研究結果是一致的[15－17]。經(jīng)小陷胸湯灌胃12周后，大鼠血清IL－6、ox－LDL、VCAM－1、CRP水平明顯降低，主動脈內(nèi)膜厚度減小，其中小陷胸湯中劑量組效果更明顯。

綜上所述，小陷胸湯可降低AS大鼠血清炎性因子水平，抑制內(nèi)膜厚度的增加，這可能是小陷胸湯抗AS的機制之一。

[1]陸在英，鐘南山，謝毅，等.內(nèi)科學[M].7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：267－274.

[2]ROSS R.Atheroscleros is an inflammatory disease[J].Am Heart J，1999，138（5Pt2）：S419－S420.

[3]MAHMOUDI M，CURZEN N，GALLAGHER PJ.A therogenesis：the role of inflammation and infection [J].Histopathology，2007，50（5）：535－546.

[4]任宏生，朱興雷，張興華，等.氯吡格雷對兔髂腹動脈球囊損傷后新生內(nèi)膜的影響[J].中國病理生理雜志，2007，23（12）：2479－2482.

[5]TAKAHASHI M.Inflammatory cytokines in the pathogenesis of atherosclerosis[J].Nihon Rinsho，2011，69（1）：30－33.Review.Japanese.

[6]李國華，李佳旻.炎癥因子與動脈粥樣硬化[J].心血管病學進展，2010，31（2）：156－158.

[7]馬愛玲，王宗仁，鄭瑾，等.芪丹通脈片對實驗性動脈粥樣硬化大鼠動脈壁ICAM－1、VCAM－1基因表達的影響[J].第四軍醫(yī)大學學報，2004，25（4）：355－358.

[8]劉娟，陳麗琴，蘇秀蘭，等.人冠狀動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)白細胞介素6和18及腫瘤壞死因子α表達與斑塊穩(wěn)定性有關[J].中國動脈硬化雜志，2008，16（7）：537－540.

[9]MONTECUCCO F，MACH F.New evidences for C－reac－tive protein（CRP）deposits in the arterial intima as a cardiovascular risk factor[J].Clin Interv Aging，2008，3（2）：341－349.Review.

[10]王偉，楊濱，王嵐，等.丹參山楂藥對對大鼠動脈粥樣硬化的影響[J].中國中藥雜志，2011，36（6）：784－789.

[11]左建國.加味小陷胸湯聯(lián)合辛伐他汀治療高脂血癥療效觀察[J].廣東醫(yī)學，2010，31（14）：1878－1880.

[12]劉遠婷，臧力學.小陷胸湯合丹參飲治療冠心病心絞痛30例臨床觀察[J].江蘇中醫(yī)藥，2012，44（9）：34－35.

[13]李景君，王蕊，徐京育.加味小陷胸湯治療不穩(wěn)定型心絞痛臨床觀察[J].中醫(yī)藥學報，2010，38（2）：123－124.

[14]郭延松，吳宗貴，楊軍柯，等.三種大鼠動脈粥樣硬化模型復制方法的比較[J].中國動脈硬化雜志，2003，11（5）：465－469.

[15]SEINO Y，IKEDA M，YMANMATO K，et al.Interleukin 6gene transcripts are expressed in human atherosclerotic lesions[J].Cytokine，1994，6（1）：87－91.

[16]吳圣賢，姜良鐸，王建云.益氣解毒活血法對動脈粥樣硬化進程中高敏C反應蛋白及相關促炎因子的影響[J].北京中醫(yī)藥大學學報，2011，34（9）：627－631，插2.

[17]楊五彪，陳群力，馬靈筠，等.黃芪多糖對兔動脈粥樣硬化內(nèi)皮素－1、C反應蛋白的影響[J].中華實用中西醫(yī)雜志，2005，18（14）：317－319.