椪柑核中檸檬苦素類(lèi)似物提取條件優(yōu)化

唐韻熙鄧放明

TANG Yun－xi1，2DENG Fang－ming1，2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)是一類(lèi)四環(huán)三萜類(lèi)植物次生代謝物質(zhì)，主要存在于蕓香科和楝科植物組織中［1］，以果核中含量較高，果皮次之，果汁中含量最低。至今發(fā)現(xiàn)柑桔果實(shí)中較常見(jiàn)且含量較高的檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)主要有：檸檬苦素、諾米林、奧巴叩酮、脫乙酰諾米林等［2］。檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)有苷元和糖苷兩種存在形式，至今已從柑橘屬植物中分離出了37種類(lèi)檸檬苦素苷元和17種類(lèi)檸檬苦素糖苷［3］。類(lèi)檸檬苦素苷元的結(jié)構(gòu)為D－環(huán)的C17位上連一個(gè)呋喃環(huán)，而且具有高度氧化的三萜醇類(lèi)誘導(dǎo)體結(jié)構(gòu)，而糖苷是由檸檬苦素類(lèi)似物苷元分子D環(huán)開(kāi)環(huán)后在C17位上和一分子葡萄糖以糖苷鍵的形式結(jié)合而成的［4］。國(guó)外對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的研究較為深入，據(jù)報(bào)道［5］，早在20世紀(jì)60年代，Arigoni和Barton就用化學(xué)和X－ray的方法對(duì)檸檬苦素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，指出檸檬苦素的分子式為C26H30O8，分子量為470。同時(shí)由于檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的苷元和糖苷兩種結(jié)構(gòu)決定了其具有一定的健康維護(hù)功能，因此學(xué)者［6，7］對(duì)其進(jìn)行了分離、鑒定和生物活性探討。Murthy等［8］發(fā)現(xiàn)柑橘中檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)和姜黃素能夠抑制結(jié)腸癌的發(fā)生。Archana等［9］用石油醚對(duì)Citrus medica Linn.種子進(jìn)行檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取，并以大白鼠為受體，研究表明，檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)能明顯降低大鼠體內(nèi)血清膽固醇、血清甘油三酯的含量，提高高密度脂蛋白膽固醇（HDL）含量，這有助于降低動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。另有研究［10，11］指出檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)還有降血糖、殺蟲(chóng)、抗病毒、抗腫瘤形成和抑菌等作用。

目前，對(duì)于檸檬苦素類(lèi)似物的提取、分離、純化和鑒定已有一定的研究，常用的提取方法主要有超聲波輔助提取法［12］、溶劑提取法［13］、超臨界 CO2提取法［14］等。其常使用乙醇或丙醇等有機(jī)物作為提取劑，但使用量大且對(duì)環(huán)境有一定污染，特別是丙醇等毒性有機(jī)物。Deepak等［15］曾采用水溶助劑法對(duì)酸橘籽中具有生物活性的檸檬苦素進(jìn)行了研究，結(jié)果表明該方法可減少有機(jī)溶劑用量且提取率較好。本研究在此基礎(chǔ)上，選擇水楊酸鈉水溶助劑進(jìn)行提取，擬對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在找到一種環(huán)境友好型且提取率高的方法，為柑桔類(lèi)水果的深加工提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

椪柑核：于湖南長(zhǎng)沙水果市場(chǎng)采購(gòu)椪柑并取籽，洗凈，50℃下烘干，用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)40目篩，保存于干燥環(huán)境中備用；

檸檬苦素標(biāo)樣：純度98%，成都曼思特生物科技有限公司；

水楊酸鈉、石油醚（60～90℃）、無(wú)水乙醇、濃硫酸、三氯化鐵、對(duì)二－甲氨基苯甲醛：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

顯色液（Ehrlich試劑）：A液：準(zhǔn)確稱(chēng)取125mg對(duì)二－甲氨基苯甲醛溶于100mL的濃硫酸和乙醇混合液（濃硫酸65mL，乙醇35mL）中；B液：準(zhǔn)確稱(chēng)取氯化鐵0.9g，用蒸溜水溶解并定容至100mL，使用時(shí)A液中加入0.5mL的B液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 儀器

可見(jiàn)分光光度計(jì)：WFJ7200型，上海龍尼柯儀器有限公司；

高速中藥粉碎機(jī)：ZN－400A型，長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW－S－4型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB－ⅢT型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101－2AB型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子分析天平：AUY220型，日本Shmadzv公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 椪柑核檸檬苦素的測(cè)定

（1）檢測(cè)波長(zhǎng)的確定：準(zhǔn)確稱(chēng)取10mg檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)樣品，用50mL無(wú)水乙醇溶解、定容，配制成200μg／mL的檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1mL該標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL試管中，加無(wú)水乙醇1mL，再加顯色液5mL，搖勻，于暗處?kù)o置30min，然后在不同波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，觀察到最大吸收峰波長(zhǎng)在490nm處。

（2）檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.00mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL試管中，并分別用無(wú)水乙醇稀釋至2mL，再分別加入5.0mL顯色液，搖均，暗處?kù)o置30min。用無(wú)水乙醇作為空白參比，在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。根據(jù)測(cè)得結(jié)果建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，檸檬苦素標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度為縱坐標(biāo)y。最終得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝0.004 1x－0.097 9，相關(guān)系數(shù)R2＝0.993 1。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure1 The standard curve of Limonin

（3）檸檬苦素提取得率的計(jì)算：將椪柑核檸檬苦素提取液定容到50mL，準(zhǔn)確吸取0.1mL于10mL試管中，準(zhǔn)確加入1.9mL無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)偌尤?mL顯色液，于490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品液的吸光度，然后根據(jù)吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得檸檬苦素類(lèi)似物濃度，最后計(jì)算待測(cè)樣品中檸檬苦素類(lèi)似物的含量，其計(jì)算公式見(jiàn)式（1）。

式中：

R——椪柑核中檸檬苦素類(lèi)似物含量，%；

V——樣品定容體積，mL；

C—— 測(cè)得的樣品濃度，μg／mL；

L——加入的樣品體積，mL；

M—— 樣品質(zhì)量，g。

1.3.2 提取椪柑核中檸檬苦素類(lèi)似物的操作方法

（1）椪柑核脫脂：稱(chēng)取一定量椪柑核粉，按料液比1∶4（m∶V）倒入適量石油醚，密封好于室溫下浸提24h。而后抽濾自然干燥至無(wú)石油醚。

（2）水溶助劑提取檸檬苦素：稱(chēng)取脫脂椪柑核粉2g（精確至0.000 1g）于100mL錐形瓶中，按料液比加入一定量的水溶助劑水楊酸鈉，于一定溫度下浸提一定時(shí)間，然后抽濾，用提取溶劑定容至50mL，即得椪柑核檸檬苦素提取液。

1.3.3 椪柑核檸檬苦素提取單因素試驗(yàn)

（1）提取時(shí)間篩選試驗(yàn)：稱(chēng)取2.0g（精確至0.000 1g）樣品粉末5份，在濃度為2mol／L的水楊酸鈉20mL，溫度為40℃下，分別浸提2，4，6，8，10h后，抽濾，定容至50mL，按1.3.1（2）法進(jìn)行顯色反應(yīng)，在490nm處測(cè)定吸光度，通過(guò)計(jì)算檸檬苦素類(lèi)似物得率，觀察浸提時(shí)間對(duì)檸檬苦素類(lèi)似物提取率的影響。

（2）提取劑濃度篩選試驗(yàn)：稱(chēng)取2.0g（精確至0.000 1g）樣品粉末5份，在40℃下提取6h，用濃度分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mol／L的水楊酸鈉20mL進(jìn)行提取，待提取完后，抽濾，定容至50mL，按1.3.1（2）法進(jìn)行顯色反應(yīng)，在490nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算得率，觀察提取劑濃度對(duì)檸檬苦素類(lèi)似物溶出的影響。

（3）提取溫度篩選試驗(yàn)：稱(chēng)取2.0g（精確至0.000 1g）樣品粉末5份，用20mL濃度為2mol／L的水楊酸鈉，分別在20，30，40，50，60℃下浸提6h，過(guò)濾，加提取試劑定容至50mL，按1.3.1（2）法進(jìn)行顯色反應(yīng)，在490nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算得率，觀察提取溫度對(duì)檸檬苦素類(lèi)似物提取率的影響。

（4）料液比篩選試驗(yàn)：稱(chēng)取2.0g（精確至0.000 1g）樣品粉末5份，按料液比1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（m∶V）加入濃度為2mol／L的水楊酸鈉，在40℃下浸提6h，過(guò)濾，定容至50mL，按1.3.1（2）法進(jìn)行顯色反應(yīng)，在490nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算得率，觀察料液比對(duì)檸檬苦素類(lèi)似物溶出的影響。

1.3.4 椪柑核檸檬苦素提取正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用提取時(shí)間、提取劑濃度、提取溫度和料液比為試驗(yàn)因素，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，以檸檬苦素得率為指標(biāo)，確定最佳提取條件，并確定各因素的影響重要性次序。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取時(shí)間對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響

由圖2可知，隨著提取時(shí)間由2h延長(zhǎng)到6h，檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的提取率逐漸增大，提取6h后出現(xiàn)了緩慢下降的趨勢(shì)，這可能是由于浸提時(shí)間延長(zhǎng)，溶劑中有效成分發(fā)生分解氧化現(xiàn)象從而降低了得率。因此，提取時(shí)間選取6h左右比較適宜。

圖2 提取時(shí)間對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響Figure2 Effects of extracting time on extraction yield of Limonin

2.2 提取劑濃度對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響

由圖3可知，隨著水楊酸鈉濃度由1mol／L增加到2mol／L，檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的提取率呈上升趨勢(shì)，在2mol／L時(shí)達(dá)到最高。但在2mol／L以后，隨水楊酸鈉濃度升高，檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的提取率稍有降低，這可能是因?yàn)槠湓?mol／L的水楊酸鈉內(nèi)已達(dá)到飽和，濃度過(guò)大反而影響檸檬苦素類(lèi)似物的提取率。同時(shí)也考慮到水溶助劑濃度升高，會(huì)導(dǎo)致最終產(chǎn)品中非目標(biāo)成分的增加，影響目標(biāo)物純度，因此，提取溶劑濃度選取2mol／L左右比較適宜。

圖3 提取劑濃度對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響Figure3 Effects of extractant concentration on extraction yield of Limonin

2.3 提取溫度對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響

一般情況下，物質(zhì)在溶劑中的溶解度會(huì)因溫度的提高而增加，但檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)作為一種天然抗氧化物質(zhì)，在高溫條件下被氧化的概率也相應(yīng)增加，致使提取效率降低。由圖4可知，提取溫度從20℃提升到40℃，檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的提取率呈上升趨勢(shì)，在40℃時(shí)達(dá)到最高。而后提取率有所下降，因此提取溫度選取40℃左右為宜。

圖4 提取溫度對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響Figure4 Effects of extracting temperature on extraction yield of Limonin

2.4 料液比對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響

溶劑用量的多少和檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)在其中的溶解率有一定的關(guān)系。由圖5可知，檸檬苦素的提取率是隨著料液比的提高而增加的。但是料液比到達(dá)1∶15（m∶V）后，上升趨勢(shì)不明顯，此時(shí)溶劑可能已經(jīng)將待提取物全部提取出。從節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本角度出發(fā)，選擇料液比1∶15（m∶V）左右為宜。

圖5 料液比對(duì)檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響Figure5 Effects of ratio of material to extractant on extraction yield of Limonin

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

為了優(yōu)化椪柑核中檸檬苦素類(lèi)似物提取條件，以檸檬苦素得率為指標(biāo)，選用提取時(shí)間、提取劑濃度、提取溫度和料液比為試驗(yàn)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平取值見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

由表2可知，用水楊酸鈉提取椪柑核中檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的最佳條件為A2B2C2（C1）D3，即提取時(shí)間為6h，提取溶劑濃度為2mol／L，提取溫度為40℃（或30℃），料液比為1∶20（m∶V）。各因素對(duì)椪柑核中檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)提取率的影響依次為D＞B＞A＞C，即料液比＞提取劑濃度＞提取時(shí)間＞提取溫度。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Design of factors and levels for L9（34）orthogonal test

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果表Table2 The result of L9（34）orthogonal test

表3 方差分析表?Table3 Analysis of variance table

由表3可知，不同料液比的試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響。

依據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，在兩組最優(yōu)條件（即1：A2B2C2D3；2：A2B2C1D3）下進(jìn)行水溶助劑法提取椪柑核檸檬苦素重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，兩組得到的檸檬苦素平均得率分別為4.21%，4.19%。因此，根據(jù)實(shí)際條件，最終選擇組1（A2B2C2D3）為最佳檸檬苦素提取條件。

3 結(jié)論

以椪柑核為原料，用水溶助劑水楊酸鈉為提取溶劑，研究椪柑核中檸檬苦素提取的優(yōu)化工藝條件。經(jīng)優(yōu)化后，水楊酸鈉提取椪柑核中檸檬苦素的最佳提取條件為提取時(shí)間6h、水楊酸鈉濃度2.0mol／L、溫度40 ℃、料液比1∶20（m∶V），在此條件下，椪柑核中檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的提取率為4.21%。該方法也證實(shí)了前人對(duì)于水溶助劑提取檸檬苦素類(lèi)似物可明顯減少有機(jī)溶劑用量的論證，且對(duì)環(huán)境的污染性小。但該方法只是采用椪柑核種子作為研究對(duì)象，在下一步的研究中，應(yīng)擴(kuò)大柑橘品種的選取面，針對(duì)果皮、果肉等不同部位進(jìn)行進(jìn)一步探討。

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