香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究

樊鑫梅， 曹文疆， 邢建國(guó)， 郭新紅， 袁 勇， 王新春，*

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002;2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院一附院，新疆 石河子832008;3.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆烏魯木齊830004)

香青蘭Dracocephalum moldavica L．為唇形科青蘭屬一年生草本植物［1］，維吾爾名為巴迪然吉布亞，臨床應(yīng)用具有抗血小板聚集、降低血液黏度、緩解冠心病、心絞痛等功效［2］。香青蘭總黃酮(total flavones from Dracocephalum moldavica)為香青蘭的主要有效成分［3-4］，近年來(lái)，本課題組前期研究工作表明，香青蘭總黃酮具有明顯的抗心肌缺血損傷、調(diào)節(jié)和改善心臟功能的作用［2，5-7］。因此，本試驗(yàn)采用經(jīng)典的結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支致急性心肌缺血模型，旨在探討香青蘭總黃酮預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HX—300動(dòng)物呼吸機(jī) (成都泰盟科技有限公司);BL—420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng) (成都泰盟科技有限公司);倒置熒光顯微鏡 (日本OLYMPUS公司);power wave XS2酶標(biāo)儀 (美國(guó)BIO-RAD公司);TDZ5—WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī) (湘儀離心機(jī)儀器有限公司);－80℃超低溫冰箱。

1.2 藥品與試劑 香青蘭總黃酮提取物 (新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所提供，純度57%，批號(hào)20100626);復(fù)方丹參滴丸 (天津天士力制藥股份有限公司，批號(hào) 110504);乳酸脫氫酶 (LDH)、肌酸激酶 (CK)、肌酸激酶同工酶 (CK-MB)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)、總超氧化物歧化酶 (T-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GSH-Px)、丙二醛 (MDA)和髓過(guò)氧化物酶 (MPO)測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)Elisa試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R＆D公司;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na北京化學(xué)試劑公司，批號(hào) 20100803);戊巴比妥鈉(北京化學(xué)試劑公司)。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量 (250～300 g)，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):新醫(yī)動(dòng)字第2003－0001號(hào)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 分組及給藥 雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只:假手術(shù)組、缺血再灌注組 (模型組)、香青蘭總黃酮預(yù)處理組 ［高、中、低劑量分別為60、30、15 mg/(kg·d)］、復(fù)方丹參滴丸陽(yáng)性藥組 ［給藥劑量為5丸/(kg·d)］。各給藥組灌胃給藥7 d，給藥體積均為5 mL/kg體質(zhì)量，每天1次。假手術(shù)組和模型組同時(shí)給予0.5%CMCNa灌胃，并于第8天給藥后10 min后行手術(shù)。

2.2 心肌缺血再灌注損傷模型的制備 大鼠末次給藥10 min后，戊巴比妥鈉 (50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定。將銀針電極插入四肢皮下，連接BL—420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)正常狀態(tài)下肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖。頸部正中切口，分離氣管，行氣管插管，打開(kāi)胸腔后接人工呼吸機(jī)(呼吸頻率:60次/min，潮氣量:2 mL/100 g，呼吸比為3∶2)，沿左鎖骨中線切開(kāi)皮膚2 cm，在第四五肋間打開(kāi)胸腔，剪開(kāi)心包，暴露心臟，穩(wěn)定10 min后，在肺動(dòng)脈圓錐左緣與左心耳下緣2 mm處進(jìn)針，進(jìn)針深度1～2 mm，寬度2～3 mm，經(jīng)淺層心肌穿一3/8絲線。穩(wěn)定5 min后，套上聚乙烯塑料套管，結(jié)扎，即完成左冠狀動(dòng)脈閉塞致心肌缺血。以心電圖S-T段抬高、T波高聳標(biāo)志心肌缺血成功;以抬高的S-T段下降、T波逐漸恢復(fù)以確定再灌注的成功［8-9］。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min后，離心 (0～4℃，3 000 r/min，10 min)，取上清放入－80℃冰箱凍存，用于血清學(xué)指標(biāo)的測(cè)定。取血后迅速取下心臟置于冰生理鹽水中，沖凈心腔內(nèi)血液，剪取結(jié)扎線以下的左心室組織凍存，用于制作組織病理切片。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

2.3.1 大鼠缺血再灌期Ⅱ?qū)?lián)心電圖S-T段變化用圖像分析軟件采集Ⅱ?qū)?lián)心電圖S-T段變化，計(jì)算各藥物組大鼠心電圖在缺血和再灌注時(shí)S-T段變化絕對(duì)值［10］。

2.3.2 大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取心尖部缺血心肌組織，置于10%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚石蠟切片，二甲苯脫蠟，蘇木精-伊紅 (HE)染色，梯度乙醇脫水，封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察。采用評(píng)分制評(píng)價(jià)組織細(xì)胞損傷程度:0分，沒(méi)有損傷;1分 (輕度損傷)，間質(zhì)水腫和局灶性壞死;2分 (中度損傷)，彌散性心肌細(xì)胞溶脹和壞死;3分 (嚴(yán)重?fù)p傷)，細(xì)胞融合性壞死并伴隨中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);4分 (極嚴(yán)重?fù)p傷)，廣泛的細(xì)胞融合性壞死，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及出血［11］。

2.3.3 血清心肌酶的檢測(cè) 檢測(cè)各組血清中LDH、CK、CK-MB和AST的活性［8］，試驗(yàn)操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行［12］。

2.3.4 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定 采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD的活性，比色法測(cè)定GSH-Px的活性，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA水平，試驗(yàn)操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.3.5 炎癥因子的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中 IL-1、IL-6和 TNF-α的水平［13］，比色法測(cè)定MPO的活性，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷心臟Ⅱ?qū)?lián)心電圖的影響 與假手術(shù)組比較，其余各組缺血期的S-T段明顯抬高，而再灌注期的S-T段較缺血期有所降低，提示模型建立成功;與模型組比較，香青蘭總黃酮高、中劑量組和丹參滴丸組在心肌缺血-再灌注 (IR)過(guò)程中S-T段抬高均顯著低于模型組 (P＜0.05或P＜0.01)，說(shuō)明香青蘭總黃酮預(yù)處理能降低大鼠心肌缺血再灌注損傷(見(jiàn)表1)。

表1 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷心電圖S-T段的影響 (±s，n=10)Tab.1 Effect of total flavones from Dracocephalum moldavica on S-T segment in rats(±s，n=10)

表1 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷心電圖S-T段的影響 (±s，n=10)Tab.1 Effect of total flavones from Dracocephalum moldavica on S-T segment in rats(±s，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

組 別 劑量/(mg·kg－1)S-T段/mv缺血后 再灌注后假手術(shù)組 － 0.13±0.03 0.12±0.04模型組 － 0.41±0.05△△ 0.36±0.07△△香青蘭總黃酮 60 0.28±0.06＊＊ 0.25±0.06＊＊30 0.34±0.05* 0.29±0.07*15 0.39±0.06 0.34±0.06丹參滴丸組 135 0.22±0.04＊＊ 0.26±0.07＊＊

3.2 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌組織病理形態(tài)學(xué)的影響 常規(guī)HE染色后在光鏡下觀察，假手術(shù)組 (0分):心肌細(xì)胞排列整齊，界限清晰，呈束狀分布，心肌細(xì)胞核形態(tài)正常，無(wú)細(xì)胞腫脹和壞死區(qū);模型組 (4分):心肌廣泛融合性病變，心肌細(xì)胞腫脹，肌纖維排列紊亂，大片狀出血壞死，細(xì)胞間中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯;香青蘭總黃酮高劑量組及丹參滴丸組 (1分):僅見(jiàn)細(xì)胞有輕度水腫，肌纖維排列較為整齊，未見(jiàn)片狀壞死;香青蘭總黃酮中劑量組 (2分)、香青蘭總黃酮低劑量組 (3分)，可見(jiàn)心肌細(xì)胞溶脹壞死并伴有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn) (見(jiàn)圖1)。

圖1 大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞組織病理學(xué)觀察(HE×200)Fig.1 Histopathologic exam ination of ischem ia-reperfusion injury m yocardium in rats(HE×200)

3.3 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷血清心肌酶的影響 與假手術(shù)組比較，模型組血清心肌酶活性明顯升高 (P＜0.01);與模型組比較，香青蘭總黃酮可劑量依賴性的降低心肌缺血再灌注損傷大鼠血清中的心肌酶的活性，其中香青蘭總黃酮高、中劑量組差異顯著 (P＜0.01或P＜0.05)，與丹參滴丸組效果相當(dāng) (見(jiàn)表2)。

3.4 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷氧化應(yīng)激的影響 與假手術(shù)組比較，模型組SOD及GSH-Px的活性明顯降低 (P＜0.05或P＜0.01)，而MDA的水平顯著升高 (P＜0.01);與模型組比較，香青蘭總黃酮高、中劑量組和陽(yáng)性藥組血清SOD及GSH-Px的活性顯著升高 (P＜0.05或P＜0.01)，而MDA的水平則明顯下降 (P＜0.01)，此外，香青蘭總黃酮低劑量組雖能提高SOD及GSH-Px的活性和MDA的水平，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (見(jiàn)表3)。

表2 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷血清心肌酶活性的影響 (±s，n=10)Tab.2 Effects of total flavones from Dracocephalum moldavica on the activities of myocardial enzyme in rats serum(x ±s，n=10)

表2 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷血清心肌酶活性的影響 (±s，n=10)Tab.2 Effects of total flavones from Dracocephalum moldavica on the activities of myocardial enzyme in rats serum(x ±s，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 劑量/(mg·kg－1) LDH/(U·mL－1) CK/(U·mL－1)CK-MB/(U·mL－1) AST/(U·mL－1)假手術(shù)組 －0.15±0.06 0.48±0.23 0.53±0.29 0.21±0.05模型組 － 0.48±0.09△△ 0.87±0.37△△ 0.94±0.24△△ 0.35±0.07△△香青蘭總黃酮高劑量組 60 0.28±0.12＊＊ 0.62±0.32＊＊ 0.78±0.31＊＊ 0.19±0.05＊＊香青蘭總黃酮中劑量組 30 0.34±0.15＊＊ 0.71±0.26* 0.86±0.26* 0.26±0.06*香青蘭總黃酮低劑量組 15 0.45±0.08 0.83±0.49 0.91±0.32 0.28±0.05*丹參滴丸組 135 0.26±0.17＊＊ 0.70±0.11＊＊ 0.69±0.43＊＊ 0.16±0.08＊＊

表3 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷血清氧化應(yīng)激的影響 (±s，n=10)Tab.3 Effect of total flavones from Dracocephalum moldavica on oxidant stress in rats serum(±s，n=10)

表3 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷血清氧化應(yīng)激的影響 (±s，n=10)Tab.3 Effect of total flavones from Dracocephalum moldavica on oxidant stress in rats serum(±s，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 劑量/(mg·kg－1) SOD/(U·mL－1) GSH-Px/(mmol·mL －1) MDA/(nmol·mL －1)假手術(shù)組 －113.2±15．6 1.92±0.15 2.73±0.55模型組 － 75.6±8．3△△ 1.63±0.12△△ 8.15±1.32△△香青蘭總黃酮高劑量組 60 124.5±10．8＊＊ 1.98±0.20* 5.62±0.87＊＊香青蘭總黃酮中劑量組 30 112.5±12．7＊＊ 1.85±0.14* 6.53±0.72＊＊香青蘭總黃酮低劑量組 15 86.7±7．5 1.65±0.18 7.30±0.94丹參滴丸組 135 119.6±10．1＊＊ 1.87±0.09* 6.08±0.53*

3.5 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷血清炎癥因子及炎癥細(xì)胞的影響 與假手術(shù)組比較，模型組血清IL-1、IL-6、TNF-α水平及MPO活性明顯升高 (P＜0.01);與模型組比較，香青蘭總黃酮各劑量組和丹參滴丸組均能降低上述炎癥因子水平及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度，并且具有一定的量效關(guān)系，其中，香青蘭總黃酮高劑量組與模型組具有顯著性差異 (P＜0.05或P＜0.01)(見(jiàn)表4)。

表4 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)的影響 (±s，n=10)Tab.4 Effect of total flavones from Dracocephalum moldavica on inflammatory factor in rats(±s，n=10)

表4 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)的影響 (±s，n=10)Tab.4 Effect of total flavones from Dracocephalum moldavica on inflammatory factor in rats(±s，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 劑量/(mg·kg－1) IL-1/(pg·mL－1) IL-6/(pg·mL－1) TNF-α/(pg·mL－1) MPO/(U·L－1)假手術(shù)組 －4.52±0.87 9.53±1.24 25.6±7．29 35.40±3.1模型組 － 18.3±2.52△△ 27.8±6.52△△ 40.5±9．53△△ 224.87±6.5△△香青蘭總黃酮高劑量組 60 12.6±3.21* 19.5±6.64* 31.6±11．2* 42.20±5.9＊＊香青蘭總黃酮中劑量組 30 14.8±4.57 23.2±9.47 36.5±8．72 83.82±8.0＊＊香青蘭總黃酮低劑量組 15 18.5±4.85 25.6±8.33 38.2±9．54 98.82±8.3*丹參滴丸組 135 11.8±2.28* 24.3±5.36* 32.4±12．2* 51.37±8.5＊＊

4 討論

大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)心肌細(xì)胞凋亡壞死，心肌組織中的LDH、CK、CK-MB和AST會(huì)漏出心肌細(xì)胞入血，致使血清中的心肌酶活力明顯升高，因此，血清心肌酶活性的高低，直接反映缺血心肌細(xì)胞的損傷程度。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，香青蘭總黃酮可以劑量依賴性的抑制血清心肌酶的活性，提示其能夠通過(guò)提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性而發(fā)揮心肌保護(hù)作用;組織病理學(xué)檢查進(jìn)一步說(shuō)明香青蘭總黃酮能夠減輕心肌細(xì)胞壞死程度，縮小病變范圍，從而改善心肌功能。

在心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中，氧化應(yīng)激及炎癥損傷貫穿于心肌細(xì)胞損傷的全過(guò)程，且能夠滲透到其它損傷因素中發(fā)揮作用。在缺血再灌注過(guò)程中，氧化應(yīng)激刺激缺血的心肌細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎癥因子，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞被激活而不斷浸潤(rùn)于心肌細(xì)胞中，誘導(dǎo)自由基大量產(chǎn)生，而SOD及GSH-Px等抗氧化酶類消耗增加，使活性氧的生成和清除的平衡被打破，從而激發(fā)心肌細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，香青蘭總黃酮除了能夠降低MDA的水平并提高抗氧化酶的活性，還能夠抑制炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α的水平，同時(shí)對(duì)中性粒細(xì)胞特征酶MPO的活性也具有很強(qiáng)的抑制作用。可見(jiàn)，香青蘭總黃酮發(fā)揮抗心肌缺血再灌注損傷的作用可能是先抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，使炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α的釋放減少，從而降低了心肌細(xì)胞中中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)而減少氧自由基的生成，促使自由基的生成和清除的平衡得以恢復(fù)，形成一個(gè)良性循環(huán)，最終達(dá)到保護(hù)心肌的作用。

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