不同類型樹(shù)脂對(duì)4種丹參酚酸類成分的動(dòng)態(tài)吸附研究

鄭云楓， 黃 利， 魏娟花， 彭國(guó)平， 李賀敏， 程建明

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210029)

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖［1］，是著名的活血化瘀中藥，其水溶性活性成分主要包括丹參素、原兒茶醛、丹酚酸A、B、C、D等丹參酚酸類成分 (salvianolic acid)，臨床已用于冠心病等心血管疾病的治療［2－3］。

傳統(tǒng)丹參酚酸的精制分離常采用醇沉法或萃取法，近些年樹(shù)脂吸附法因其高效、宜于工業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用，但已有的研究大多集中于單一大孔樹(shù)脂吸附［4－6］，且評(píng)價(jià)指標(biāo)往往采用單個(gè)成分或總酚酸 (分光光度法檢測(cè))，缺乏系統(tǒng)性或?qū)傩浴?/p>

本實(shí)驗(yàn)選取了丹參中4種代表性丹酚酸類化合物:丹參素 (danshensu)、原兒茶醛 (protocate chualdehyde)、丹酚酸D(salvianolic acid D)和丹酚酸B(salvianolic acid B)為考察指標(biāo)，采用高效液相色譜法，分別考察了大孔樹(shù)脂、聚酰胺樹(shù)脂及陰離子交換樹(shù)脂對(duì)各丹酚酸類化合物的動(dòng)態(tài)吸附分離特性，為建立不同類型樹(shù)脂聯(lián)用制備丹參酚酸的必要性和可行性提供依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent色譜工作站 (美國(guó)安捷倫科技有限公司);TGL—16G高速離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠);1810—D型自動(dòng)雙重純水蒸餾器 (上海申生科技有限公司);BT—220S電子天平 (賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);玻璃色譜柱 (1.5 cm×40 cm，南京恩賜化玻有限公司)。

丹參提取物 (丹參滴注液中間體)由上海華源安徽錦輝制藥提供，批號(hào):05120209;對(duì)照品:丹參素鈉 (批號(hào):0855－200102)、原兒茶醛 (批號(hào):110810－200205)、丹酚酸 B(批號(hào):111562－200807)對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)生物藥品檢定所，供定量測(cè)定用，純度＞98%;丹酚酸D對(duì)照品 (實(shí)驗(yàn)室自制，純度＞98%)。樹(shù)脂類型:大孔吸附樹(shù)脂(AB－8，南開(kāi)大學(xué)化工廠);聚酰胺樹(shù)脂 (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);陰離子交換樹(shù)脂 (201×7，滄州寶恩化工有限公司)。乙腈 (色譜純，fisher有限公司);冰醋酸 (色譜純，天津市北辰方正試劑廠);乙醇為分析純;實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)自動(dòng)雙重純水蒸餾器處理。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜條件［7］Kormasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相為乙腈 (A)和1%冰乙酸 (B)進(jìn)行梯度洗脫，0～20 min，5% ～15%A，20～50 min由15% ～40%A;進(jìn)樣量10μL;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)281 nm;體積流量1.0 mL/min。在此色譜條件下，各峰分離良好，見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的配制及線性關(guān)系 精密稱取丹參素鈉(20.12 mg)，原兒茶醛 (2.05 mg)，丹酚酸D(15.16 mg)，丹酚酸B(15.10 mg)對(duì)照品，20%乙腈水溶液定容至25 mL，備用。

圖1 對(duì)照品與供試品溶液的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference and samples

精密量取對(duì)照品溶液，采用倍比稀釋法，分別制成系列質(zhì)量濃度的溶液，吸取上述系列溶液各10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積。以峰面積 (Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為丹參素鈉:Y=6.456 8 X－6.234 1(R2=0.999 8);原兒茶醛:Y =44.246 3 X－9.146 9(R2=0.999 6);丹酚酸 D:Y=10.673 2 X－11.021 7(R2=0.999 6);丹酚酸B:Y=11.107 8 X－4.583 0(R2=0.999 7)。結(jié)果表明，丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸D、丹酚酸B分別在50.3～804.8μg/mL、5.1～82.0μg/mL、37.9～606.4 μg/mL、37.8～604.0μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.3 供試品溶液的配制及定量測(cè)定結(jié)果 丹參提取物 (500 mL)，加蒸餾水稀釋至10 L，過(guò)濾，即得供試品溶液，4℃避光貯藏，備用。精密量取供試品溶液5.0 mL，置于10 mL量瓶中，用20%乙腈水溶液稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，HPLC分析，并以2.2項(xiàng)下回歸方程計(jì)算質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示供試品溶液中，丹參素質(zhì)量濃度為0.462 mg/mL，原兒茶醛質(zhì)量濃度為0.030 mg/mL，丹酚酸 D質(zhì)量濃度為 0.335 mg/mL，丹酚酸B質(zhì)量濃度為0.274 mg/mL。

2.4 樹(shù)脂預(yù)處理 大孔吸附樹(shù)脂:取大孔樹(shù)脂先用2 BV(1 BV為1個(gè)柱床體積)2 mol/L的氫氧化鈉溶液洗滌，以蒸餾水洗至中性;再用2 BV的2 mol/L的鹽酸溶液洗滌，以蒸餾水洗至中性;再用95%乙醇洗滌，檢查流出的乙醇液，至乙醇液與水混合 (1∶5)無(wú)白色渾濁為止，最后以蒸餾水洗至無(wú)醇味。

聚酰胺樹(shù)脂:取聚酰胺樹(shù)脂，用蒸餾水浸泡24 h，先用2 BV的2 mol/L的氫氧化鈉溶液洗滌，以蒸餾水洗至中性;再用2 BV的2 mol/L的鹽酸溶液洗滌，以蒸餾水洗至中性;再用95%乙醇洗滌，檢查流出的乙醇液，至乙醇液與水混合 (1∶5)無(wú)白色渾濁為止，最后以洗至無(wú)醇味。

陰離子交換樹(shù)脂:取陰離子交換樹(shù)脂，用蒸餾水浸泡24 h，并用蒸餾水洗至水液澄清，傾去水后加1 mol/L的鹽酸溶液浸泡24 h，水洗至中性，最后加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡24 h，并用水洗至中性。

2.5 丹參酚酸在不同類型樹(shù)脂上的動(dòng)態(tài)吸附研究

分別取25 mL處理好的大孔樹(shù)脂 (干樹(shù)脂量為6 g)，聚酰胺樹(shù)脂 (干樹(shù)脂量為5 g)和陰離子交換樹(shù)脂 (干樹(shù)脂量為6 g)，裝柱 (1.5 cm×14 cm，1 BV=25 mL)，水洗，另取供試品溶液500 mL 3份，以1 mL/min的體積流量通過(guò)以上3種樹(shù)脂柱，流出液分份收集，每25 mL為1流份，HPLC測(cè)定流出液中各成分濃度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，取平均值，繪制3種樹(shù)脂對(duì)4種丹參酚酸類化合物的動(dòng)態(tài)泄漏曲線。見(jiàn)圖2。從圖中可以看出，大孔樹(shù)脂和聚酰胺樹(shù)脂對(duì)4種酚酸類成分的泄漏曲線較為相似:對(duì)丹參素幾乎不吸附，對(duì)原兒茶醛的吸附效果也并不理想，且兩者的泄漏速率較快;對(duì)丹酚酸D及丹酚酸B的吸附效果較好，泄漏速率相對(duì)平緩。而陰離子交換樹(shù)脂的吸附特征與以上兩種樹(shù)脂不同，對(duì)丹參素及原兒茶醛的吸附效果明顯強(qiáng)于極性較小的丹酚酸D及丹酚酸B。

飽和吸附量:以流出液中藥物質(zhì)量濃度超過(guò)供試品溶液中藥物質(zhì)量濃度的5%時(shí)，可認(rèn)為樹(shù)脂對(duì)于該藥物成分的吸附已達(dá)到飽和［8］，此時(shí)的上樣體積也可稱為泄漏體積。不同類型樹(shù)脂對(duì)各成分的飽和吸附量可按以下公式計(jì)算。

飽和吸附量=(供試品藥物質(zhì)量濃度×泄漏體積)/干樹(shù)脂質(zhì)量。

結(jié)果見(jiàn)表1。從表中可以看出，丹酚酸D和丹酚酸B在大孔樹(shù)脂上的飽和吸附量最高，為22.3 mg/mL和27.4 mg/mL，聚酰胺樹(shù)脂與之相似，但陰離子交換樹(shù)脂對(duì)這兩種成分的吸附量較低，僅有大孔樹(shù)脂的1/4～1/6;而丹參素和原兒茶醛在陰離子交換樹(shù)脂上的飽和吸附量較高，分別達(dá)30.8 mg/g和3.2 mg/g，分別是另外兩種樹(shù)脂的6倍和3倍。

圖2 4種丹參酚酸在不同類型樹(shù)脂上的泄漏曲線Fig.2 Adsorption leaking curves of four salvianolic acids on different adsorbent resins

表1 不同類型樹(shù)脂對(duì)4種丹參酚酸的動(dòng)態(tài)飽和吸附量Tab.1 Dynam ic adsorption capacity of four salvianolic acids on different adsorbent resins

2.6 丹參酚酸在不同類型樹(shù)脂上的動(dòng)態(tài)解吸附研究 分別取25 mL體積處理好的大孔樹(shù)脂 (干樹(shù)脂量為6 g)，聚酰胺樹(shù)脂 (干樹(shù)脂量為5 g)和陰離子交換樹(shù)脂 (干樹(shù)脂量為6 g)，裝柱 (1.5 cm×14 cm，1 BV=25 mL)，水洗，另取供試品溶液150 mL(6 BV)三份，以1 mL/min的體積質(zhì)量通過(guò)以上3種樹(shù)脂柱。將吸附后的樹(shù)脂，依次用水，10%、20%、40%、60%、80%乙醇 (各 3 BV)，以1 mL/min體積流量洗脫，洗脫液分份收集，每25 mL(1 BV)為1流份，HPLC測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，取平均值，繪制不同樹(shù)脂對(duì)4種丹酚酸類化合物的動(dòng)態(tài)解吸附曲線。見(jiàn)圖3。并按以下公式計(jì)算未超過(guò)樹(shù)脂飽和吸附量的化合物解吸附率。

解吸率 (%)=(洗脫液體積分?jǐn)?shù)×洗脫液體積)/(供試品液體積分?jǐn)?shù)×上樣體積)×100%

圖3 4種丹參酚酸在不同類型樹(shù)脂上的解吸附曲線Fig.3 Desorption curves of four salvianolic acids on different adsorbent resins

結(jié)果可以看出，丹參素和原兒茶醛在大孔樹(shù)脂及聚酰胺樹(shù)脂上容易被解吸附，水即可將這兩種酚酸洗脫下來(lái)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9］;丹酚酸D在以上兩種樹(shù)脂上的解吸附曲線相似，60%乙醇可將其洗脫完全，但丹酚酸D在大孔樹(shù)脂上的解吸附率達(dá)86.1%，高于在聚酰胺樹(shù)脂上79.4%的解吸附率;丹酚酸B在大孔樹(shù)脂上適宜的洗脫劑為60%乙醇，其解吸附率達(dá)82.9%，均優(yōu)于聚酰胺60%～80%乙醇洗脫劑和70.3%的解吸附率。而在離子交換樹(shù)脂上，丹參素和原兒茶醛的解吸附過(guò)程較為緩慢，40%～60%乙醇可相對(duì)集中地將其洗脫下來(lái)，解吸附率分別為67.4%和72.8%，但丹酚酸D和丹酚酸B在離子交換樹(shù)脂上解吸附較為困難，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)80%乙醇洗脫液中仍未能有效洗脫下丹酚酸B。

可見(jiàn)，在丹參酚酸類成分的精制分離過(guò)程中，雖然大孔樹(shù)脂和聚酰胺樹(shù)脂對(duì)于總酚酸中丹酚酸D及丹酚酸B等成分的富集效果較好，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致丹參素及原兒茶醛成分的大量損失;相反，離子交換樹(shù)脂對(duì)丹參素及原兒茶醛的吸附和解吸附效果較好，對(duì)另兩種酚酸類成分富集效果卻并不理想。

3 討論

采用HPLC法同時(shí)檢測(cè)了4種具有代表性結(jié)構(gòu)的酚酸成分，與單一成分或紫外法測(cè)定總酚酸相比，具有受干擾小，評(píng)價(jià)更為全面、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

大孔樹(shù)脂具有吸附量大，解吸附率高，再生能力強(qiáng)等特點(diǎn)［10－11］，與聚酰胺相比更適宜于富集丹酚酸B等結(jié)構(gòu)為二聚體以上的酚酸類成分，其對(duì)丹酚酸D和丹酚酸B的飽和吸附量分別達(dá)22.3 mg/g和27.4 mg/g;而陰離子交換樹(shù)脂對(duì)丹參素及原兒茶醛等成分的吸附效能較高，飽和吸附量分別為30.6 mg/g及3.2 mg/g;鑒于單一樹(shù)脂的分離局限性以及不同樹(shù)脂在分離上的互補(bǔ)性，在精制分離丹參總酚酸或單一成分時(shí)可采用大孔樹(shù)脂與陰離子交換樹(shù)脂聯(lián)合使用，應(yīng)能取得理想的效果。

依據(jù)文獻(xiàn)［9，12－13］本實(shí)驗(yàn)僅選用了弱極性 AB－8型大孔樹(shù)脂，60～100目規(guī)格聚酰胺以及強(qiáng)堿型201×7型陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行了研究，未對(duì)不同型號(hào)樹(shù)脂的吸附特性進(jìn)行考察，因而在后續(xù)進(jìn)行樹(shù)脂聯(lián)用制備總酚酸或單一成分研究時(shí)，還需要進(jìn)一步優(yōu)選不同樹(shù)脂的型號(hào)，考察其吸附及解吸附能力，提升精制分離的效果。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:70.

［2］周長(zhǎng)新，羅厚蔚，丹羽正武.丹參水溶性化學(xué)成分的研究［J］. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，30(6):411－416.

［3］Zeng G F，Xiao H B，Liu JX，et al．Identification of phenolic constituents in Radix Salvia miltiorrhizae by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2006，20(3):499－506.

［4］房信勝，譚曉梅，王建華.大孔吸附樹(shù)脂純化丹參總酚酸的工藝研究［J］. 中草藥，2006，37(10):1502－1504.

［5］李 丹，宋洪濤，初 陽(yáng)，等.大孔吸附樹(shù)脂純化丹參水溶性總酚酸工藝研究［J］.中國(guó)藥房，2009，20(15):1142－1145.

［6］張霄翔，邵勝男，周慧慧，等.大孔吸附樹(shù)脂純化丹參總酚酸的工藝研究［J］. 中成藥，2007，29(9):1288－1291.

［7］丁 寧，鄭云楓，程建明，等.RP－HPLC法分離丹參滴注液中的丹酚酸D及測(cè)定4種酚酸類的含量［J］.中國(guó)藥房，2012，23(8):744－746.

［8］Fu Y J，Zu Y G，Liu W，et al．Preparative separation of vitexin and isovitexin from pigeonpea extracts with macroporous resins［J］.J Chromatogr A，2007，1139(2):206－213.

［9］王妍妍，朱靖博，李 琳，等.大孔樹(shù)脂對(duì)丹參中5種丹酚酸類化合物的吸附分離特性［J］.中國(guó)中藥雜志，2008，33(9):1004－1007.

［10］宋麗軍，趙文昌.HPLC雙指標(biāo)研究大孔樹(shù)脂純化甘草酸的優(yōu)化工藝及圖譜分析［J］.中成藥，2011，33(7):1252－1254

［11］魏冬青，陳紹民，苗建武.丹參總酚酸大孔樹(shù)脂純化工藝［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(3):42－44.

［12］苗建武，陳紹民，王 超，等.聚酰胺樹(shù)脂分離純化丹參總酚酸的研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(3):28－30.

［13］亢 炎，佟繼銘.陰離子交換樹(shù)脂分離純化赤雹果中的總有機(jī)酸［J］.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，26(3):237－239.