響應(yīng)面法優(yōu)化藥對柴胡—黃芩的揮發(fā)油提取工藝及其化學(xué)成分GC-MS分析

羅 蘭， 管淑玉

(廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州510006)

藥對是臨床上常用的配伍形式，雖然組成相對簡單，但它具有中藥配伍的基本特點(diǎn)［1］。藥對配伍的研究是復(fù)方配伍規(guī)律研究的基礎(chǔ)和重要切入點(diǎn)之一，了解兩藥配伍后的化學(xué)成分變化，有利于剖析和闡明復(fù)方中藥的配伍機(jī)理［2-4］。藥對柴胡—黃芩是《傷寒論》柴胡類方中最具代表意義的基本配伍，具有疏肝解郁、清肝泄膽的功效，現(xiàn)代臨床將它作為清泄肝膽的經(jīng)典藥對倍加推崇，用于肝郁氣滯所致的痞積腫塊等癥，療效顯著。目前關(guān)于藥對柴胡—黃芩配伍的研究多集中在藥理作用［5-10］方面，而關(guān)于該藥對配伍的化學(xué)成分報道甚少。本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken設(shè)計原理和響應(yīng)面法［11-15］確定水蒸汽蒸餾法提取藥對揮發(fā)油的最佳工藝條件，利用GC-MS分析藥對柴胡—黃芩配伍前后的揮發(fā)油成分，從而為闡釋藥對柴胡—黃芩的物質(zhì)基礎(chǔ)內(nèi)涵提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

安捷倫7890A-5970C氣質(zhì)聯(lián)用儀;BP211D精密天平 (德國賽多利斯);揮發(fā)油提取器;粉碎機(jī)FZ102(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

柴胡為北柴胡Bupleurum chinense DC．的干燥根 (購自廣州致信中藥飲片有限公司);黃芩為黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根 (購自廣州致信中藥飲片有限公司)。以上藥材均經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥資源系李書淵教授鑒定。藥對柴胡黃芩按1∶1的劑量混合。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥對柴胡黃芩揮發(fā)油的提取方法 根據(jù)《中國藥典》2010版一部附錄XD，采用水蒸汽蒸餾法進(jìn)行揮發(fā)油提取。

分別將柴胡、黃芩藥材粉碎過篩，精密稱取柴胡、黃芩藥材粉末各50 g，置于同一圓底燒瓶中，加入相應(yīng)倍數(shù)的水振搖混勻，浸泡，加入玻璃珠數(shù)粒，緩緩加熱至沸，并保持微沸至規(guī)定時間，停止加熱，放置至冷卻，接收揮發(fā)油，無水硫酸鈉除去揮發(fā)油中水分，精密測定揮發(fā)油體積，計算揮發(fā)油得率。

2.2 單因素試驗(yàn) 以揮發(fā)油得率為考察指標(biāo)，采用單因素法考察提取時間、液料比、藥材粒度、浸泡時間等因素對揮發(fā)油提取率的影響。

2.2.1 提取時間對揮發(fā)油得率的影響 按2.1項(xiàng)下的方法提取揮發(fā)油，固定液料比 (8倍)、藥材粒度 (40目)、浸泡時間 (60 min)，考察不同提取時間 (4、6、8、10、12 h)對揮發(fā)油得率的影響，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取時間對揮發(fā)油得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of volatile oil

由圖1可知，提取時間在4～8 h范圍內(nèi)，揮發(fā)油得率隨著提取時間的增加而迅速提高。但在8 h后，隨著提取時間的增加，揮發(fā)油得率變化很小。

2.2.2 液料比對揮發(fā)油得率的影響 按2.1項(xiàng)下的方法提取揮發(fā)油，固定提取時間 (8 h)、藥材粒度 (40目)、浸泡時間 (60 min)，考察不同液料比 (4、6、8、10、12倍)對揮發(fā)油得率的影響，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果見圖2。

圖2 不同液料比對揮發(fā)油得率的影響Fig.2 Effect of solvent/sample ratio on extraction rate of volatile oil

由圖2可知，液料比在4～8倍范圍內(nèi)，揮發(fā)油得率隨著液料比的增加而迅速提高。但在8倍以后，隨著液料比的增加，揮發(fā)油得率變化很小。

2.2.3 藥材粒度對揮發(fā)油得率的影響 按2.1項(xiàng)下的方法提取揮發(fā)油，固定提取時間 (8 h)、液料比 (8倍)、浸泡時間 (60 min)，考察藥材不同粒度 (10、20、40、60、80目)對揮發(fā)油得率的影響，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果見圖3。

圖3 藥材不同粒度比對揮發(fā)油得率的影響Fig.3 Effect of different particle sizes on extraction rate of volatile oil

由圖3可知，藥材粒度在10～40目范圍內(nèi)，揮發(fā)油得率隨著藥材粉末目數(shù)的增加而迅速提高。但在40目以后，隨著目數(shù)的增加，揮發(fā)油得率變化很小。

2.2.4 浸泡時間對揮發(fā)油得率的影響 按2.1項(xiàng)下的方法提取揮發(fā)油，固定提取時間 (8 h)、液料比 (8倍)、藥材粒度 (40目)，考察不同浸泡時間 (15、30、60、90、120 min)對揮發(fā)油得率的影響，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果見圖4。

由圖4可知，浸泡時間在15～60 min范圍內(nèi)，揮發(fā)油得率隨著浸泡時間的增加而提高，但在60 min以后，隨著浸泡時間的增加，揮發(fā)油得率變化很小。

2.3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

圖4 不同浸泡時間比對揮發(fā)油得率的影響Fig.4 Effect of different soak time on extraction rate of volatile oil

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計及實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理和單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取時間、液料比、藥材粒度三個因素為自變量，揮發(fā)油得率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平17個實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中12個為析因?qū)嶒?yàn)，5個為中心實(shí)驗(yàn)。因素水平見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)的因素與水平Tab.1 Vairables and levels in response surface methodology experimental design

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of response surface methodology experim ental design

2.3.2 建立模型方程與顯著性檢驗(yàn) 利用軟件Design-Expert 7.0對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到揮發(fā)油得率與各因素變量的二次方程模型為 Y (%) = －0.501 15+ 0.058 462 A+0.077 775 B+0.004 501 25 C－6.25×10－5AB－1.25×10－5AC－6.25×10－6BC －2.962 5×10－3A2－4.65×10－3B2－5.587 5×10－5C2。對回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Tab.3 Analytic results of variance

由表3可知，提取時間和液料比的一次項(xiàng)均達(dá)到極顯著性水平，二次項(xiàng)對揮發(fā)油提取的曲面效應(yīng)極顯著，交互項(xiàng)交互效應(yīng)不顯著，表明各影響因素對揮發(fā)油得率的影響是簡單的線性關(guān)系。該二次方程模型達(dá)到極顯著水平，模型的相關(guān)系數(shù)r=(8.107×10－3/8.210×10－3)×100%=98.75%，說明響應(yīng)值的變化有98.75%來源于所選變量，可以用此模型對揮發(fā)油的提取效果進(jìn)行分析。失擬項(xiàng)F值為0.41，表明失擬項(xiàng)相對于絕對誤差不顯著，而不顯著的失擬項(xiàng)才是可取的，說明該回歸方程對試驗(yàn)擬合情況較好，該模型能夠較好的描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對因素A、B、C所構(gòu)成的三維空間曲面圖，從響應(yīng)面圖上可形象地看出各參數(shù)之間的相互作用。結(jié)果見圖5～7。

從圖5～7的等高線形狀可看出，提取時間、液料比和藥材粒度相互之間的交互作用不顯著。圖5中沿A軸的等高線密度變化相對沿B軸的變化較大，說明提取時間對揮發(fā)油得率的影響比液料比大;圖6中A軸的等高線密度變化相對沿C軸的變化較大，說明提取時間對揮發(fā)油得率的影響比藥材粒度大。

圖5 提取時間、液料比對揮發(fā)油得率交互影響的三維響應(yīng)面圖Fig.5 3D response surface p lot of extraction time，solvent/sam p le ratio and their m utual interactions on the yield of volatile oil

圖6 提取時間、藥材粒度對揮發(fā)油得率交互影響的三維響應(yīng)面圖Fig.6 3D response surface p lot of extraction tim e，particle sizes and their mutual interactions on the yield of volatile oil

2.3.4 提取條件優(yōu)化 根據(jù)軟件Design-Expert 7.0分析，藥對揮發(fā)油的最佳提取工藝條件為提取時間9.7 h，液料比8.27倍，藥材粒度38.72目，藥對揮發(fā)油得率的理論值可達(dá)0.191%。為方便實(shí)驗(yàn)操作，將最佳提取工藝條件中的藥材粒度修正為40目，實(shí)際測得的揮發(fā)油得率為0.189%，RSD為1.05%，與理論值相符，所以基于響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝條件準(zhǔn)確可靠。

圖7 液料比、藥材粒度對揮發(fā)油得率交互影響的三維響應(yīng)面圖Fig.7 3D response surface plot of solvent/sample ratio，particle sizes and their mutual interactions on the yield of volatile oil

2.4 藥對柴胡—黃芩及各單味藥材的揮發(fā)油成分GC-MS分析

2.4.1 GC-MS分析條件 DB-5MS毛細(xì)管柱 (60 m×0.32 mm，0.25μm);載氣為He;進(jìn)樣口溫度為280℃;程序升溫40℃，保持5 min，2℃/min升溫至240℃，保持10 min，4℃/min升溫至280℃，保持10 min;離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃;譜庫為wiely7n.l。

2.4.2 樣品溶液的制備 按照最佳提取工藝條件，并按2.1項(xiàng)下的揮發(fā)油提取方法，分別提取藥對柴胡—黃芩及單味藥材柴胡、黃芩的揮發(fā)油，再分別精密吸取揮發(fā)油1 mL，置于100 mL量瓶中，并用乙酸乙酯稀釋至刻度，混勻，即得3個樣品溶液。

2.4.3 GC-MS分析結(jié)果 吸取上述3個樣品溶液各1μL，進(jìn)行GC-MS分析，按照面積歸一化法計算相對含有量。總離子流圖見圖8，化學(xué)成分分析結(jié)果見表4。

由表4可知，從藥對柴胡—黃芩及單味藥材柴胡、黃芩的揮發(fā)油中分別鑒定了116個組分、85個組分和43個組分，分別占其揮發(fā)油總量的90.23%、91.02%和92.01%。藥對揮發(fā)油主要含有脂肪酸、烷烴、萜類和芳香族化合物，在成分種類上幾乎是單味藥材柴胡、黃芩二者的加和，且主要來自于柴胡，表明柴胡在藥對揮發(fā)油成分中占主導(dǎo)地位。藥對揮發(fā)油中含有量較高的成分有棕櫚酸(13.75%)、苯乙酮 (8.76%)、糠醛 (4.33%)、芥酸酰胺 (4.20%)、庚醛 (3.08%)亞油酸(2.37%)、壬酸 (2.31%)等。

圖8 藥對柴胡黃芩及單味藥材柴胡、黃芩的揮發(fā)油GC-MS總離子流圖Fig.8 GC-MS total ion chromatogram s of the volatile oil from Bupleurum chinense，Scutellaria b aicalensis，and their herbal pair

3 討論

響應(yīng)面法是通過對響應(yīng)面等值線的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的一種統(tǒng)計方法。與正交實(shí)驗(yàn)相比，其優(yōu)勢是:在實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)過程中，可以連續(xù)的對實(shí)驗(yàn)的各個水平進(jìn)行分析，而正交實(shí)驗(yàn)只能對一個個孤立的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析。但是響應(yīng)面法仍有其局限性，該方法的前提是設(shè)計的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)應(yīng)包括最佳的實(shí)驗(yàn)條件。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法得到揮發(fā)油得率與各因素變量的二次方程模型，該二次方程模型達(dá)到極顯著水平，模型的相關(guān)系數(shù)為98.75%，該回歸方程對試驗(yàn)擬合情況較好，并確定了藥對揮發(fā)油的最佳提取工藝條件為提取時間9.7 h，液料比8.27倍，藥材粒度40目。

本實(shí)驗(yàn)采用GC-MS對藥對柴胡—黃芩及單味藥材柴胡、黃芩的揮發(fā)油成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明藥對揮發(fā)油在成分種類上幾乎是單味柴胡、黃芩二者的加和，且主要來自于柴胡，說明柴胡在藥對揮發(fā)油成分中占主導(dǎo)地位。

表4 藥對柴胡—黃芩及單味藥材柴胡、黃芩揮發(fā)油的化學(xué)成分Tab.4 Chem ical com positions of volatile oil from Bupleurum chinense，Scutellaria baicalensis，and their herbal pair

續(xù)表4

［1］章巧萍．藥對探析［J］．中華中醫(yī)藥雜志，2005，20(4):204-206．

［2］蔣永光，曹 莉，陳 穎，等．中藥藥對的組配形式及臨床應(yīng)用［J］．遼寧中醫(yī)雜志，2005，32(11):1119-1120．

［3］孟祥樂，余 奇，郭 澄．中藥藥對的臨床應(yīng)用與配伍機(jī)制研究概述［J］．中國藥房，2009，20(30):2394-2396．

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［11］劉 江，樊鈺虎，王澤秀，等．響應(yīng)面法優(yōu)化姜黃揮發(fā)油提取工藝及其化學(xué)成分研究［J］．西南師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2012，37(10):70-76．

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［15］湯 磊，劉 本．響應(yīng)面法優(yōu)化白芍中芍藥苷的超臨界流體提取研究［J］．中成藥，2010，32(8):1332-1337．