藠頭總甾體皂苷對高脂大鼠降脂作用研究

雷榮劍， 李 軍， 金圣煊， 徐淑媛， 晏桂敏， 何俏軍

(1.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310058;2.杭州創(chuàng)新中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究所有限公司，浙江杭州310053)

高脂血癥是動脈粥樣硬化及相關(guān)疾病如冠心病、缺血性腦血管疾病和外周血管疾病的主要誘因。患者在臨床上表現(xiàn)的特征為血清中總膽固醇(TC)、總甘油三酯 (TG)、低密度脂蛋白 (LDLC)的升高及高密度脂蛋白 (HDL－C)的降低［1］。目前臨床用于調(diào)節(jié)高血脂癥的藥物主要為他汀類，能顯著降低血清中 (LDL－C)等水平，其使用能大大降低心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，然而，而單靠服用他汀類藥物并不能完全滿足臨床上所有患者對調(diào)節(jié)高血脂癥的需要，因?yàn)樗☆愃幬锏陌悬c(diǎn)比較單一，且他汀類藥物的過多服用也存在如皮疹等副作用［2］。藠頭Allium chinense G.Don，又名薤，記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是百合科蔥屬植物，它的干燥鱗莖作為薤白的藥用來源之一，被2010年版《中國藥典》收載［3］。藠頭除了作為藥食兩用作物在中國廣泛使用外，在世界上其他國家也廣泛應(yīng)用于香料調(diào)味品和蔬菜［4］。藠頭既可食用又能入藥，具有多種藥理作用和保健功能，其中就包括對心血管疾病如高血脂、高血壓、高血糖癥的調(diào)節(jié)及在血小板聚集、血纖維蛋白溶解過程的調(diào)節(jié)作用［5］。研究表明甾體皂苷如薯蕷皂苷、番麻皂素、菝契皂苷及異菝葜皂苷類物質(zhì)是百合科植物的主要活性成分，大多具有增加冠脈流量、營養(yǎng)心肌、改善外周循環(huán)、抑制血小板聚集及降低血清總膽固醇和甘油三酯等藥理作用［6－7］。目前僅有研究發(fā)現(xiàn)從藠頭中提取分離的甾體皂苷成分對環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶和Na+－K+－ATP 酶有抑制作用［8］，而對該成分在高脂血癥上起的調(diào)節(jié)作用未有報(bào)道，本文研究工作便以此為切入點(diǎn)，通過高脂飼料喂養(yǎng)誘發(fā)高脂大鼠模型，考察藠頭總甾體皂苷給藥后對其血脂水平、抗氧化能力、脂蛋白代謝酶和肝臟細(xì)胞形態(tài)的影響，從血清學(xué)、病理學(xué)等角度闡明藠頭總甾體皂苷對高脂血癥的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量約180 g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2 儀器與試藥 Agilent 1100系列高效液相色譜儀，DAD檢測器，甲醇、乙腈均為色譜純，乙醇為分析純，水為自制重蒸水。菝葜皂苷元(中檢所，1539200001)。美國伯樂680酶標(biāo)儀。藠頭鮮品，采自浙江新昌，經(jīng)浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院助理研究員余陳歡鑒定為Allium chinense G.Don的干燥鱗莖;豬油自制，膽固醇 (國產(chǎn))，膽鹽，蛋黃;脂蛋白脂酶 (LPL)，肝酯酶 (HL)，谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH－Px)，超氧化物歧化酶 (SOD)，丙二醛 (MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 藠頭總甾體皂苷的制備 取500 g新鮮的藠頭，加10倍量 (質(zhì)量比)的80%乙醇回流提取兩次，每次2 h，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至約200 mL(乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10%以下)。濃縮液加蒸餾水300 mL稀釋后靜置過夜，取下層沉淀加150 mL水稀釋，加等量 (體積比)水飽和正丁醇萃取3次，合并萃取液，減壓回收正丁醇并濃縮至干，殘留物加95%乙醇攪拌至溶解完全后，加丙酮至無沉淀產(chǎn)生，抽濾，取濾液濃縮后減壓干燥，得3 g左右白色干燥物，保存于4℃冰箱［9］。參考Miao等發(fā)表的文獻(xiàn)方法［10］，取少量干燥物進(jìn)行Liebermann－Burchard顯色反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果呈陽性，提示總甾體皂苷可能是白色干燥物主要成分。

1.2.2 HPLC分析 為了測定藠頭總甾體皂苷中甾體皂苷元的量，試驗(yàn)采用反相高效液相色譜法:ZORBAX Extent－C18色譜 柱 (4.6mm × 250mm，5 μm)，柱溫30℃，以乙腈－水為流動相，乙腈為38%，體積流量1 mL/min，檢測波長204 nm，進(jìn)樣量10μL。在HPLC測定前，將0.2 g總甾體皂苷溶解于20 mL 2 mol/L稀鹽酸并加熱回流2 h，冷卻后加40%氫氧化鈉至pH中性溶液，溶液用三氯甲烷萃取3次，每次25 mL，合并萃取液減壓回收三氯甲烷至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?5 mL量瓶，過0.45μm濾膜，供HPLC測定［11］。

1.2.3 動物實(shí)驗(yàn)方法 取雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分成6組，每組8只，即空白對照組、高血脂模型組、藠頭總甾體皂苷低劑量組 (50 mg/kg)，藠頭總甾體皂苷中劑量組(100 mg/kg)，藠頭總甾體皂苷高劑量組(200 mg/kg)，陽性藥洛伐他汀對照組 (2.5 mg/kg)。給予正常飼料1周后，除空白對照組給予正常飼料外，其他各組均用高脂飼料［12］(78.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽鹽)喂養(yǎng)，動物自由飲水。在給予高脂飼料4周后，空白對照組和模型組大鼠給予同量水，總甾體皂苷各給藥組及洛伐他汀對照組連續(xù)灌胃4周，每周稱量體質(zhì)量1次。

1.2.4 血清測定及肝臟形態(tài)學(xué)觀察 在末次給藥后24 h，于10%水合氯醛麻醉 (35 mg/kg，腹腔注射)下，自大鼠腹主動脈取血，于3 000 r/min離心10 min后取血清，測定血清中總膽固醇 (TC)、總甘油三酯 (TG)、低密度脂蛋白 (LDL－C)、丙二醛 (MDA)、高密度脂蛋白 (HDL－C)、谷胱甘肽過氧化酶 (GSH－Px)和超氧化物歧化酶 (SOD)的水平。大鼠肝臟取出后，稱取200 mg肝組織加10%生理鹽水勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液測脂蛋白酯酶 (LPL)和肝脂酶 (HL)的水平。在肝臟最大葉距邊緣0.5 cm處取肝組織 (約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm)用0.9%氯化鈉溶液沖洗，浸泡于10%福爾馬林溶液過夜，經(jīng)脫水、石蠟包埋及切片后得到約4μm的切片，用蘇木精染色后至光鏡觀察［13］。

2 結(jié)果

2.1 HPLC分析 因文獻(xiàn)報(bào)道菝葜皂苷元 (sarsasapogenin)為藠頭甾體皂苷的主要水解產(chǎn)物［14－15］，試驗(yàn)擬采用菝葜皂苷元為對照品定量測定藠頭總甾體皂苷。色譜圖見圖1，樣品中菝葜皂苷元分離度良好 (18.988 min)，藠頭總甾體皂苷中菝葜皂苷元純度為8.2%。以菝葜皂苷元為對照品，經(jīng)香草醛－冰醋酸－高氯酸紫外顯色法測定藠頭總甾體皂苷純度為65.7%［16］。

圖1 總甾體皂苷高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of total steroidal saponins

2.2 藠頭總甾體皂苷對大鼠血清TC、TG、LDL－C及HDL－C水平的影響 如表1所示，經(jīng)給藥4周后，與空白對照組比較，喂飼高脂飼料的模型組大鼠血清 TC、TG、LDL－C水平明顯增高 (P＜0.05)，分別增加115%、147%、93%，而HDL－C水平下降23%(P＜0.05)，提示高脂飼料喂養(yǎng)后的大鼠符合用于篩選治療藥物要求。與模型組比較，藠頭總甾體皂苷給藥組和洛伐他汀組對高脂飼料誘導(dǎo)的高血脂大鼠的TC、TG、LDL－C水平、動脈硬化指數(shù)AI［AI=(總膽固醇－高密度脂蛋白)÷高密度脂蛋白］均有降低作用，其中藠頭總甾體皂苷中劑量組和高劑量組給藥后不僅分別降低TC為33%和44%、TG為24%和42%、LDL－C為32%和38%(P＜0.05)，而且分別升高HDL－C為18%和24%(P＜0.05)。表明中、高劑量的藠頭總甾體皂苷給藥對高脂飼料喂養(yǎng)誘發(fā)的大鼠高脂血癥具有較好的調(diào)節(jié)作用。

表1 藠頭總甾體皂苷對大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影響 (±s，n=8)Tab.1 Effects of total steroidal saponins on serum levels of TC，TG，LDL-C and HDL-C in rats(±s，n=8)

表1 藠頭總甾體皂苷對大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影響 (±s，n=8)Tab.1 Effects of total steroidal saponins on serum levels of TC，TG，LDL-C and HDL-C in rats(±s，n=8)

注:與高血脂模型組相比較，*P＜0.05

組 別TC/(mmol·L －1)TG/(mmol·L －1)HDL－C/(mmol·L －1)LDL－C/(mmol·L －1)動脈硬化指數(shù)空白對照組 1.11±0.31* 0.86±0.08* 1.02±0.22* 0.67±0.11*0.09±0.02高血脂模型組 2.39±0.41 2.12±0.49 0.79±0.13 1.30±0.21 2.01±0.28陽性對照組 1.15±0.25* 1.23±0.13* 0.95±0.12* 0.73±0.27* 0.20±0.03*藠頭總甾體皂苷低劑量組 1.88±0.38 1.72±0.25 0.87±0.11 0.95±0.18* 1.16±0.31*藠頭總甾體皂苷中劑量組 1.60±0.20* 1.62±0.37* 0.93±0.15* 0.89±0.21* 0.72±0.22*藠頭總甾體皂苷高劑量組 1.33±0.24* 1.24±0.28* 0.98±0.21* 0.80±0.15* 0.37±0.09*

2.3 藠頭總甾體皂苷對大鼠肝臟HL和LPL水平的影響 HL和LPL在血清甘油三酸酯類物質(zhì)清除中扮演重要角色，其中LPL作為脂肪分解酶能將甘油三酯、乳糜微粒中的磷脂、中密度脂蛋白等水解［17］。而HL作為肝細(xì)胞合成的脂肪分解酶對脂蛋白代謝也具有多方面影響，其活性與LDL和HDL顆粒存在的大小和密度相關(guān)［18－19］。如表2所示，空白組和模型組間的HL和LPL水平?jīng)]有顯著性差異。相比空白組，洛伐他汀組的LPL值略微升高，而HL值卻有所減少，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［20］。藠頭總甾體皂苷給藥組的HL和LPL值顯著升高，其中藠頭總甾體皂苷高劑量組相對于空白、模型及洛伐他汀組，分別升高HL值 (39%，30%，53%)(P＜0.05)，升高 LPL值 (49%，28%，60%)(P＜0.05)。表明藠頭總甾體皂苷高劑量組給藥能提高高脂大鼠肝臟HL和LPL水平。

表2 藠頭總甾體皂苷對大鼠肝臟HL和LPL水平的影響(±s，n=8)Tab.2 Effects of total steroidal saponins on hepatic levelsof HL and LPL in rats(±s，n=8)

表2 藠頭總甾體皂苷對大鼠肝臟HL和LPL水平的影響(±s，n=8)Tab.2 Effects of total steroidal saponins on hepatic levelsof HL and LPL in rats(±s，n=8)

注:與高血脂模型組相比較，*P＜0.05

組 別HL/(U·mg prot－1)LPL/(U·mg prot－1)空白對照組1.23±0.19 0.93±0.17高血脂模型組 1.31±0.23 1.09±0.19陽性對照組 1.12±0.22 1.07±0.13藠頭總甾體皂苷低劑量組 1.44±0.25 1.17±0.19藠頭總甾體皂苷中劑量組 1.57±0.28 1.28±0.26*藠頭總甾體皂苷高劑量組 1.71±0.31* 1.39±0.27*

2.4 藠頭總甾體皂苷對大鼠血清GSH－Px、MDA、SOD水平的影響 研究表明血液中存在的SOD/GSH－Px等抗氧化酶有助于清除體內(nèi)氧自由基和阻止脂質(zhì)過氧化發(fā)生，而MDA是脂質(zhì)過氧化的重要終末產(chǎn)物之一，其水平的多少預(yù)示脂質(zhì)過氧化的速率和強(qiáng)度［21］。本實(shí)驗(yàn)通過對血清 GSH－Px、MDA、SOD的測定，以進(jìn)一步明確藠頭總甾體皂苷調(diào)節(jié)血脂的作用機(jī)制。如表3所示，與空白組相比，模型組的GSH－Px和SOD水平顯著降低。與模型組相比，藠頭總甾體皂苷給藥組的GSH－Px和SOD水平顯著升高，且呈劑量依賴性趨勢，其中藠頭總甾體皂苷高劑量組升高了GSH－Px和SOD水平分別為25%、23%(P＜0.05)。另一方面，模型組MDA水平顯著上升 (P＜0.05)，而相比模型組，藠頭總甾體皂苷和洛伐他汀組的MDA水平都呈下降趨勢，特別是中、高劑量的藠頭總甾體皂苷給藥顯著降低MDA水平 (P＜0.05)。以上結(jié)果表明藠頭總甾體皂苷給藥能提升大鼠體內(nèi)抗氧化酶水平及降低血清MDA水平。

表3 藠頭總甾體皂苷對大鼠血清GSH-Px、MDA、SOD水平的影響 (±s，n=8)Tab.3 Effects of total steroidal saponins on serum levels of GSH-Px，MDA and SOD in rats(±s，n=8)

表3 藠頭總甾體皂苷對大鼠血清GSH-Px、MDA、SOD水平的影響 (±s，n=8)Tab.3 Effects of total steroidal saponins on serum levels of GSH-Px，MDA and SOD in rats(±s，n=8)

注:與高血脂模型組比較，*P＜0.05

組 別GSH－Px/(U·mL－1)SOD/(U·mL－1)MDA/(nmol·mL －1)空白對照組 502±46.2* 425±43.5* 3.78±0.74*高血脂模型組 386±37.6 327±29.4 7.05±1.45陽性對照組 467±42.7* 406±41.8* 4.30±0.93*藠頭總甾體皂苷低劑量組 426±33.1 351±28.1 5.77±1.10*藠頭總甾體皂苷中劑量組 457±49.8* 382±43.3* 5.69±1.25*藠頭總甾體皂苷高劑量組 482±40.3* 401±46.0* 5.29±1.12*

2.5 肝臟形態(tài)學(xué)觀察 對各組大鼠的肝臟病理切片經(jīng)400倍放大觀察如圖2所示?？瞻讓φ战M少見脂肪滴存在。模型組肝細(xì)胞脂肪變性腫脹，肝細(xì)胞內(nèi)含有大小不等的脂肪滴。洛伐他汀對照組可見少量小脂肪滴存在。藠頭總甾體皂苷低劑量組可見比較多的小脂肪滴存在。藠頭總甾體皂苷中劑量組可見相對模型組較少的脂肪滴。藠頭總甾體皂苷高劑量組肝細(xì)胞內(nèi)脂肪滴較模型組明顯減少，多以小脂滴存在。以上結(jié)果說明藠頭總甾體皂苷中、高劑量組能改善高血脂癥大鼠的肝臟脂代謝，有效減少脂肪滴的產(chǎn)生，其結(jié)果與表1所測的血清學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)意義一致。

圖2 藠頭總甾體皂苷對高血脂癥大鼠肝組織病理形態(tài)的影響 (400倍)Fig.2 Histopathological analysis of total steroidal saponins in the liver of the hyperlipidem ia rats(×400)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以百合科蔥屬植物具有多種藥理作用和保健功能為依據(jù)，對藥食兩用植物藠頭在高脂血癥上起的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明藠頭中甾體皂苷成分能有效調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠多項(xiàng)血脂水平，提高其體內(nèi)部分脂肪分解酶及抗氧化酶水平，有效減少脂肪滴的產(chǎn)生，改善高血脂癥大鼠的肝臟脂代謝。然而，僅以大鼠模型對藠頭甾體皂苷成分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究還是不夠的，如增加其他模型如轉(zhuǎn)基因小鼠等進(jìn)行深入研究，則對闡明藠頭甾體皂苷成分調(diào)血脂的多靶點(diǎn)作用機(jī)理有積極意義，故在下一步研究中應(yīng)予以重視。

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