維藥羅勒提取物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7生長(zhǎng)及其胞內(nèi)5-脂氧酶活性的影響

米娜瓦爾·哈帕爾， 阿孜古麗·吐?tīng)栠d， 周文婷， 程路峰， 依巴代提·吐乎提，娜迪熱·熱依木， 艾尼瓦爾·吾買(mǎi)爾*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，新疆烏魯木齊830011;2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)室，新疆烏魯木齊830011;3.新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)科，新疆烏魯木齊830063)

羅勒Ocimum basilicum L．是維吾爾醫(yī)應(yīng)用歷史悠久的常用藥材之一，是唇形科植物羅勒的地上部分，一年生草本，全國(guó)各地均有栽培。羅勒具有疏風(fēng)解表、化濕和中、行氣活血、強(qiáng)心安神、解毒消腫等功效［1-2］，主治感冒頭疼、發(fā)熱咳嗽、中暑等。其主含的化學(xué)成分有揮發(fā)油類、黃酮及其苷類、香豆素類，此外還含有三萜類和生物堿類等成分［3-4］。本課題組前期發(fā)現(xiàn)羅勒乙酸乙酯提取物對(duì)環(huán)氧合酶途徑具有抑制作用［5-8］，本研究旨在檢測(cè)羅勒提取物對(duì)經(jīng)脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)以及胞內(nèi)5-酯氧酶活性的影響，探討羅勒提取物對(duì)體內(nèi)花生四烯酸代謝網(wǎng)絡(luò)的另一通路——5-酯氧酶途徑的可能影響。

1 材料與方法

1.1 儀器 倒置熒光顯微鏡 (OLYMPUS，日本);高速多功能冷凍離心機(jī) (BR4i型，法國(guó));生物安全柜 (Haier，中國(guó));CO2培養(yǎng)箱 (Thermo，美國(guó));全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 (Benchmark PLUS，德國(guó))。

1.2 試劑與材料 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(RAW264.7)購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù) (中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC);羅勒:2010年9月采自新疆吐魯番市托克遜縣種植基地，品種由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天藥/生藥學(xué)教研室帕麗達(dá)·阿不力孜教授鑒定;DMEM干粉培養(yǎng)基 (GIBCO公司);胎牛血清 (FBS)(GIBCO公司);四唑藍(lán) (MTT)(Sigma公司);吲哚美辛 (Sigma公司);脂多糖脂多糖 (Sigma公司);前列腺素 E2(PEG2)ELISA試劑盒 (GBD公司，批號(hào):BA3248)，花生四烯酸 (Sigma公司);胰蛋白酶 (GIBCO公司);PBS緩沖液;白三烯B4ELISA試劑盒 (武漢中美科技有限公司，批號(hào):BA2043);NDGA(Sigma公司)。

1.3 方法

1.3.1 羅勒的提取與分離 將陰干后的羅勒地上部分剪碎，稱取200 g，在室溫條件下用2 600 mL、75%乙醇密閉浸泡24 h后采用超聲儀進(jìn)行提取，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮回收乙醇得到乙醇提取物，再用適量水分散提取物后，依次用乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液揮干后得到羅勒提取物 (羅勒乙酸乙酯、羅勒正丁醇提取物)，冷凍干燥。實(shí)驗(yàn)時(shí)用適量的二甲基亞砜DMSO溶解后，用DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需的質(zhì)量濃度，再以0.22μm濾器過(guò)濾，放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇后的RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含有10%胎牛血清、青霉素100μg/mL、鏈霉素100μg/mL的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約3～5 d細(xì)胞鋪滿80%瓶底后，用0.25%胰蛋白酶消化約3～5 min后傳代。根據(jù)需要部分細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)，部分收集計(jì)數(shù)后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 繪制RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，采用一般的傳代方法進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液。以1×105個(gè)/mL的密度將細(xì)胞接種于96孔板中，按MTT法［9］，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，每天1次，連續(xù)10 d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 觀察羅勒提取物對(duì)正常RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 以適量的二甲基亞砜溶液DMSO溶解羅勒乙酸乙酯和羅勒正丁醇提取物以后，以含10%FBS和雙抗的DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需藥物溶液 (400、200、100、50、25μg/mL)，稀釋后的藥物溶液中DMSO的終體積分?jǐn)?shù)控制在0.5%以內(nèi) (預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)12.5μg/mL的藥物溶液在任何一個(gè)時(shí)間段對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)均無(wú)明顯作用，而細(xì)胞加入600、800μg/mL的藥物溶液后，到48 h細(xì)胞就會(huì)脫落，導(dǎo)致死亡)，于4℃ 冰箱備用。按MTT法于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定24、48、72、96 h時(shí)的OD值，求出IC50值，并計(jì)算細(xì)胞的存活率。

1.3.5 羅勒提取物對(duì)經(jīng)脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 采用細(xì)胞存活率為90%左右的藥物濃度，即羅勒乙酸乙酯提取物和羅勒正丁醇提取物最大給藥質(zhì)量濃度為100μg/mL。再設(shè)五個(gè)梯度 (公比為2)，配置時(shí)以DMEM培養(yǎng)基稀釋，通過(guò)MTT法檢測(cè)羅勒提取物對(duì)不同時(shí)間脂多糖處理后的RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)步驟:將指數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL，設(shè)空白組，模型組 (以脂多糖刺激致炎)，陽(yáng)性對(duì)照組(白三烯B4終濃度為100μmol/L)和給藥組 (不同質(zhì)量濃度的羅勒提取物)，每組4個(gè)復(fù)孔，放置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。次日棄去舊培養(yǎng)基，除空白組外，其余每孔均加入脂多糖溶液200μL(1 mg/L)，于培養(yǎng)箱中孵育12 h后，棄去每孔上清液，空白組與模型組加入新鮮培養(yǎng)基，其它組分別加入配置好的各組藥物，每孔200μL，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h。依照MTT法，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞的存活率。

1.3.6 羅勒提取物在體外對(duì)5-脂氧酶活性的影響

將指數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL，設(shè)空白組，模型組 (以脂多糖刺激致炎)，陽(yáng)性對(duì)照組(白三烯B4終濃度為100μmol/L)和給藥組 (不同質(zhì)量濃度的羅勒提取物)，每組4個(gè)復(fù)孔，放置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。次日更換舊培養(yǎng)基，除空白組以外的其它孔均加入終質(zhì)量濃度1 mg/L的脂多糖進(jìn)行干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，給藥組分別加入配置好的不同質(zhì)量濃度的羅勒提取物，空白組和模型組加入終體積分?jǐn)?shù)為0.5%的DMSO，放置孵箱中繼續(xù)孵育。24 h后每個(gè)組加入終濃度為10μmol/L的底物花生四烯酸，37℃孵育30 min，收集細(xì)胞上清液，－20℃凍存待測(cè)。用ELISA法 (嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作)測(cè)定細(xì)胞上清液中白三烯B4的濃度，并計(jì)算抑制率。

抑制率 =［(模型組OD值 －給藥組OD值)/模型組OD值］×100%

2 結(jié)果

2.1 MTT法繪制RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線 經(jīng)過(guò)觀察RAW264.7細(xì)胞10 d的基本生長(zhǎng)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)接種后的24 h內(nèi)細(xì)胞的吸光度有一定的下降，再經(jīng)過(guò)24 h的滯留期后，細(xì)胞將進(jìn)入一個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，從接種后的第7天開(kāi)始細(xì)胞的生長(zhǎng)保持在一個(gè)比較平穩(wěn)的狀態(tài)。所得結(jié)果顯示，24 h與48 h的OD值與0 h的OD值相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);3～10 d，OD值結(jié)果與0 h組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。根據(jù)此結(jié)果確定RAW264.7細(xì)胞在接種后的第48小時(shí)開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即視該時(shí)間段為干預(yù)細(xì)胞的最佳時(shí)期，可以較合理地觀察說(shuō)明干預(yù)因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律的影響。根據(jù)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律隨時(shí)間的變化繪制出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖，見(jiàn)圖1。

圖1 MTT法繪制RAW 264.7細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.1 Cell growth curve of RAW 2647 by MTT

2.2 MTT法確定羅勒提取物對(duì)正常RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.2.1 羅勒乙酸乙酯提取物對(duì)正常RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 在體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中加入終質(zhì)量濃度為25、50、100、200、400μg/mL的羅勒乙酸乙酯提取物分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)受到不同的影響。結(jié)果表1。

表1 羅勒乙酸乙酯提取物在不同時(shí)間作用下對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響 (±s，n=3)Tab.1 Effect of Ocimum basilicum L．ethyl acetate extract on the proliferation of RAW 264.7 cells in the different time(±s，n=3)

表1 羅勒乙酸乙酯提取物在不同時(shí)間作用下對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響 (±s，n=3)Tab.1 Effect of Ocimum basilicum L．ethyl acetate extract on the proliferation of RAW 264.7 cells in the different time(±s，n=3)

注:與空白組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

分 組OD值24 h 48 h 72 h 96 h空白組 0.296±0.053 0.381±0.033 0.389±0.019 0.466±0.019模型組 0.280±0.021 0.377±0.009 0.379±0.028 0.453±0.022羅勒乙酸乙酯提取物25 μg/L組 0.285±0.012 0.379±0.020 0.386±0.010＊＊## 0.371±0.018＊＊##羅勒乙酸乙酯提取物50 μg/L組 0.267±0.013*# 0.329±0.029＊＊## 0.369±0.021*# 0.299±0.011＊＊##羅勒乙酸乙酯提取物100 μg/L組 0.266±0.018*# 0.322±0.044＊＊## 0.365±0.017*# 0.284±0.019＊＊##羅勒乙酸乙酯提取物200 μg/L組 0.258±0.037*# 0.281±0.019＊＊## 0.310±0.023＊＊## 0.213±0.013＊＊##羅勒乙酸乙酯提取物400 μg/L組 0.062±0.011＊＊## 0.095 ±0.022＊＊## 0.048±0.025＊＊## 0.024±0.012＊＊##

除400μg/mL以外的其他劑量給藥組，在給藥后的72 h之前細(xì)胞的吸光度會(huì)一直升高，72 h之后會(huì)持續(xù)下降。組間分析結(jié)果表明，細(xì)胞的存活率隨著給藥質(zhì)量濃度的增大而不斷降低，具有質(zhì)量濃度依賴性。24 h時(shí)的IC50值為312.5μg/mL，給藥質(zhì)量濃度為400μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率在20%以下，對(duì)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。

2.2.2 羅勒正丁醇提取物對(duì)正常RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 在體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中加入終質(zhì)量濃度為25、50、100、200、400μg/mL的羅勒正丁醇提取物分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)受到不同的影響。給藥后的24 h內(nèi)，25、50μg/mL的藥物質(zhì)量濃度對(duì)RAW264.7細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用，細(xì)胞存活率為106%、102%。結(jié)果如表2所示，在給藥后的72 h之前，各個(gè)給藥組細(xì)胞的吸光度持續(xù)升高，72 h之后反而下降。組間分析結(jié)果表明，細(xì)胞的存活率隨著給藥劑量的增大而不斷下降，具有一定的劑量依賴性。在24 h的IC50值為350.9μg/mL，達(dá)到400μg/mL時(shí)，對(duì)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。

表2 羅勒正丁醇提取物在不同時(shí)間作用下對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響 (±s，n=3)Tab.2 Effect of Ocimum basilicum L．butanol acetate extract on the proliferation of RAW 264.7 cells in the different time(±s，n=3)

表2 羅勒正丁醇提取物在不同時(shí)間作用下對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響 (±s，n=3)Tab.2 Effect of Ocimum basilicum L．butanol acetate extract on the proliferation of RAW 264.7 cells in the different time(±s，n=3)

注:與空白組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

分 組OD值24 h 48 h 72 h 96 h空白組 0.296±0.053 0.381±0.033 0.389±0.019 0.466±0.019模型組 0.280±0.021 0.377±0.009 0.379±0.028 0.453±0.022羅勒正丁醇提取物25 μg/mL組 0.313±0.014 0.375±0.016 0.377±0.012＊＊## 0.337±0.013＊＊##羅勒正丁醇提取物50 μg/mL組 0.302±0.019* 0.328±0.014＊＊## 0.363±0.012＊＊## 0.281±0.014＊＊##羅勒正丁醇提取物100 μg/mL組 0.287±0.009* 0.309±0.015＊＊## 0.357±0.032＊＊## 0.276±0.019＊＊##羅勒正丁醇提取物200 μg/mL組 0.219±0.013*# 0.277±0.019＊＊## 0.333±0.009＊＊## 0.261±0.010＊＊##羅勒正丁醇提取物400 μg/mL 組 0.128±0.007＊＊## 0.174 ±0.016＊＊## 0.192±0.011＊＊## 0.067±0.017＊＊##

2.3 羅勒有效提取物對(duì)經(jīng)脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 每個(gè)時(shí)間段的模型組與對(duì)應(yīng)的空白組相比較，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，說(shuō)明細(xì)胞致炎成功。經(jīng)脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞受到各組藥物作用12 h后，各組藥物與模型組相比較，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。24 h和48 h，除6.25μg/mL組外，其它給藥組與脂多糖組相比其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，對(duì)經(jīng)脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞均有增殖作用。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 羅勒提取物對(duì)經(jīng)脂多糖刺激的RAW 264.7細(xì)胞的增殖作用 (±s，n=3)Tab.3 Proliferation to RAW 264.7 cells of polar extracts of Ocimum basilicum L．stimulated by lipopolysaccharide(±s，n=3)

表3 羅勒提取物對(duì)經(jīng)脂多糖刺激的RAW 264.7細(xì)胞的增殖作用 (±s，n=3)Tab.3 Proliferation to RAW 264.7 cells of polar extracts of Ocimum basilicum L．stimulated by lipopolysaccharide(±s，n=3)

注:與空白組比較，#P ＜0.05，#P ＜0.01;與模型組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

分 組 劑量12 h 24 h 48 h空白組 －0.682±0.471 0.729±0.056 0.889±0.071模型組 1.00μg/mL 0.307±0.109# 0.223±0.057## 0.076±0.001##吲哚美辛 10－7 mol/L 0.531±0.037 0.597±0.022＊＊ 0.623±0.012＊＊陽(yáng)性對(duì)照組 10－4 mol/L 0.496±0.023 0.538±0.045＊＊ 0.551±0.031＊＊羅勒乙酸乙酯提取物 6.25μg/mL 0.356±0.092 0.335±0.015 0.303±0.044＊＊羅勒乙酸乙酯提取物 12.50μg/mL 0.374±0.026 0.384±0.003＊＊ 0.650±0.158＊＊羅勒乙酸乙酯提取物 25.00μg/mL 0.456±0.174 0.552±0.137＊＊ 0.667±0.114＊＊羅勒乙酸乙酯提取物 50.00μg/mL 0.545±0.099 0.631±0.048＊＊ 0.724±0.077＊＊羅勒乙酸乙酯提取物 100.00μg/mL 0.555±0.015 0.636±0.036＊＊ 0.784±0.091＊＊羅勒正丁醇提取物 6.25μg/mL 0.487±0.211 0.273±0.011 0.183±0.011羅勒正丁醇提取物 12.50μg/mL 0.528±0.233 0.501±0.042＊＊ 0.414±0.001＊＊羅勒正丁醇提取物 25.00μg/mL 0.496±0.079 0.526±0.132＊＊ 0.537±0.131＊＊羅勒正丁醇提取物 50.00μg/mL 0.522±0.109 0.574±0.041＊＊ 0.617±0.014＊＊羅勒正丁醇提取物 100.00μg/mL 0.525±0.072 0.619±0.151＊＊ 0.676±0.019＊＊

2.4 羅勒有效提取物在體外對(duì)5-脂氧酶活性的影響 由表4得出，模型組與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，證明細(xì)胞模型建造成功。各藥組與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，可以判斷羅勒乙酸乙酯提取物和羅勒正丁醇提取物均對(duì)白三烯B4均有抑制作用，羅勒乙酸乙酯提取物的抑制作用大于羅勒正丁醇提取物。而對(duì)白三烯B4的抑制作用隨著給藥劑量的提高逐漸增大，存在著一定的量效關(guān)系?？梢?jiàn)，羅勒提取物對(duì)5-脂氧酶的活性有抑制作用。

3 討論

確定有效給藥劑量是進(jìn)行藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)之前的非常重要的試驗(yàn)步驟。本研究首先通過(guò)維藥羅勒不同提取物對(duì)正常RAW264.7細(xì)胞的干預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定了不同質(zhì)量濃度的維藥羅勒乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物對(duì)正常RAW264.7細(xì)胞有不同的影響，而羅勒乙酸乙酯提取物對(duì)細(xì)胞增殖的影響大于羅勒正丁醇提取物，400μg/mL的羅勒乙酸乙酯提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性大于相同質(zhì)量濃度的羅勒正丁醇提取物，倆者均降低了細(xì)胞的存活率。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，藥物質(zhì)量濃度達(dá)到400μg/mL時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)明顯的損傷現(xiàn)象 (細(xì)胞體積縮小，突起消失，間隙增大)，這可能與巨噬細(xì)胞吞噬了大量的脂質(zhì)后轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，從而加重細(xì)胞的損傷有關(guān)［10］。因此在進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，將此質(zhì)量濃度排除在外。在相同的時(shí)間段內(nèi)，羅勒乙酸乙酯提取物和羅勒正丁醇提取物均隨著質(zhì)量濃度的增大，其對(duì)細(xì)胞的毒性也逐漸增大?？梢酝茢嗔_勒提取物質(zhì)量濃度與其對(duì)細(xì)胞的毒性作用之間有著一定的量效關(guān)系。

表4 羅勒不同提取物對(duì)5-脂氧酶活性的影響 (±s，n=3)Tab.4 Effects on 5-lipoxygenase enzyme activity of different extracts of Ocimum basilicum L．(±s，n=3)

表4 羅勒不同提取物對(duì)5-脂氧酶活性的影響 (±s，n=3)Tab.4 Effects on 5-lipoxygenase enzyme activity of different extracts of Ocimum basilicum L．(±s，n=3)

注:與空白組比較，#P＜0.05;與模型組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與羅勒乙酸乙酯比較，+P＜0.01

分 組 劑 量 白三烯B4質(zhì)量濃度/(ng·L－1)抑制率/%空白組 － 121.69±5.48 －模型組 1μg/mL 293.45±7.41## －陽(yáng)性對(duì)照組 100μmol/L 133.24±4.46＊＊ 54.59羅勒乙酸乙酯提取物 100μg/mL 167.91±23.99＊＊ 42.78羅勒乙酸乙酯提取物 50μg/mL 174.04±16.91＊＊ 40.69羅勒乙酸乙酯提取物 25μg/mL 186.83±3.38＊＊ 36.33羅勒正丁醇提取物 100 μg/mL 180.08±15.25＊＊+ 38.63羅勒正丁醇提取物 50 μg/mL 181.89±13.46＊＊+ 38.02羅勒正丁醇提取物 25 μg/mL 215.71±30.32＊＊+26.49

在進(jìn)行檢測(cè)炎癥因子水平之前，需要考慮維藥羅勒提取物對(duì)被脂多糖刺激致炎后的RAW264.7細(xì)胞會(huì)有什么樣的影響并且確定其給藥劑量。脂多糖是一種重要的致病介質(zhì)，來(lái)源于革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁。根據(jù)進(jìn)入機(jī)體的劑量不同，會(huì)引起不同程度的炎癥和中毒反應(yīng)［11-12］。脂多糖對(duì)天然免疫細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用是脂多糖致病的核心機(jī)制［13］。本實(shí)驗(yàn)所采用的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，當(dāng)被脂多糖刺激之后，細(xì)胞的生理環(huán)境將會(huì)發(fā)生變化，細(xì)胞的存活率也將隨之下降。結(jié)合以上MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定安全劑量范圍，對(duì)脂多糖刺激后的細(xì)胞進(jìn)行了試驗(yàn)觀察，發(fā)現(xiàn)羅勒提取物對(duì)經(jīng)脂多糖刺激后的細(xì)胞有增殖作用，這可能與其抑制了脂多糖所致的炎癥因子有關(guān)。

多不飽和脂肪酸花生四烯酸 (arachidonic acid)是多種生物活性物質(zhì)的前提，作為一種重要的人體必需脂肪酸，它具有重要的生理，病理作用?；ㄉ南┧岽x網(wǎng)絡(luò)是炎癥代謝網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)核心網(wǎng)絡(luò)［14］。人體的花王四烯酸代謝網(wǎng)絡(luò)中，主要有兩條代謝路徑:①通過(guò)環(huán)氧酶 (cyclooxygenase，COX)的作用生成各種前列腺素 (prostaglandins，PGs);②通過(guò)脂氧酶 (5-lipoxygenase)的作用生成白三烯 (leukotrienes)，脂質(zhì)過(guò)氧化物［15］，這些代謝產(chǎn)物可能引起或加重機(jī)體的一些炎癥反應(yīng)?，F(xiàn)有研究證明，生物組織細(xì)胞膜富含的花生四烯酸經(jīng)專一酶催化產(chǎn)生的代謝物除了調(diào)控許多生理過(guò)程外，還在炎癥反應(yīng)中起重要作用［16］。

脂氧合酶 (Lipoxygenase，LOX)是一種氧合酶，作為一種含非血紅素鐵的蛋白，其代謝產(chǎn)物白三烯類物質(zhì)是一種強(qiáng)烈的炎癥介質(zhì)，對(duì)哮喘、類風(fēng)濕、過(guò)敏性鼻炎及癌癥等常見(jiàn)多發(fā)病的發(fā)生發(fā)展起到很大的作用。通過(guò)檢測(cè)羅勒提取物對(duì)5-脂氧酶代謝產(chǎn)物白三烯B4的影響發(fā)現(xiàn)，給藥組的存活率明顯高于模型組。這是因?yàn)榱_勒提取物抑制了5-脂氧酶活性，炎癥因子白三烯B4的釋放受到限制。羅勒乙酸乙酯提取物對(duì)5-脂氧酶代謝產(chǎn)物白三烯B4的抑制率明顯大于羅勒正丁醇提取物，羅勒乙酸乙酯提取物可能是羅勒發(fā)揮抗炎作用的有效部位。

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