高壓酶解大米蛋白抗氧化活性及其分子質(zhì)量分布

王章存 崔勝文 袁道強 趙學(xué)偉 安廣杰 李樂靜

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002)

蛋白質(zhì)酶解后產(chǎn)生的小分子肽不僅更容易被人體吸收，還具有不同的生物活性［1］，如提高免疫力、抗氧化、抗疲勞、止疼、鎮(zhèn)靜等，甚至在化妝品中也有很大的的應(yīng)用潛力。其中抗氧化活性肽因有利于對預(yù)防和治療自由基誘發(fā)的各種疾病而備受關(guān)注［2］。

大米蛋白是公認的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，不僅氨基酸組成合理，還具有抗糖尿病、抗膽固醇等重要的保健功能［3］。大米蛋白酶解物也表現(xiàn)出良好的抗氧化活性［2，4］。因此，開發(fā)利用大米蛋白質(zhì)資源具有重要意義。通過傳統(tǒng)的堿溶酸沉法直接從大米胚乳中提取蛋白質(zhì)有一定的經(jīng)濟局限性［5］。大米淀粉糖生產(chǎn)中有大量的副產(chǎn)品——俗稱米渣蛋白，但因在淀粉糖生產(chǎn)中，大米蛋白受到了高溫處理而發(fā)生了聚集作用，在水中的溶解性較差，常規(guī)酶解方法也只能使約50%的大米蛋白溶解［5］。

大量研究表明，高壓處理可以改變蛋白質(zhì)顆粒的聚集狀態(tài)和高級結(jié)構(gòu)，從而影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，也影響蛋白質(zhì)的酶解模式［6－8］。例如，胃蛋白酶難以水解 β－乳球蛋白(β－Lg)，但 β－Lg經(jīng)過200 MPa高壓處理后很容易被該酶水解［9］;經(jīng)600 MPa處理后，可在1 min內(nèi)被水解成1 500 u以下的小分子［10］。卵清蛋白經(jīng)200 MPa高壓處理后，用胰凝乳蛋白酶水解可加速釋放具有降血壓作用的3種活性肽［11］。大豆蛋白經(jīng)400 MPa處理20 min后，其堿性蛋白酶水解抗氧化活性均高于未高壓處理的酶解物［12］。

高壓處理也可改變大米蛋白的結(jié)構(gòu)，并提高其溶解性［13］。本試驗研究大米蛋白經(jīng)不同高壓預(yù)處理后再用堿性蛋白酶水解所得產(chǎn)物的抗氧化活性，用正交試驗法優(yōu)化了酶解條件，并分析了酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布等，為大米蛋白活性肽的進一步分離純化和構(gòu)效關(guān)系研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

大米分離蛋白(凱式定氮法測定其粗蛋白質(zhì)量分數(shù)75.6%):湖北漢科生物科技公司;堿性蛋白酶Alcalase 2.4L:諾維信公司;其他試劑為分析純。

1.2 主要儀器

UHP900×2－Z高壓設(shè)備:包頭文天科技公司;LC600高效液相色譜儀、UV8100B紫外可見光分光光度計:Lab－Tech公司;TSK gel G2000 SWXL凝膠色譜柱(7.8×300 mm):日本TOSOH公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品高壓處理

分別準確稱取大米蛋白10.0 g懸浮于100 mL的pH 8.0水溶液中，裝入兩層聚乙烯塑料袋(8 cm×10 cm)中真空密封(不留頂隙)，置于高壓裝置內(nèi)腔，浸沒于加壓介質(zhì)中，于25℃、壓力300、500 MPa下分別處理10 min。升壓、降壓均在1 min內(nèi)完成。

1.3.2 酶解試驗

在高壓處理后的樣品(pH 8.0)中加入堿性蛋白酶Alcalase后，單因素試驗確定反應(yīng)因素及其水平后，再按照正交試驗(表1)的條件反應(yīng)，其間滴加1 mol/L NaOH溶液維持pH的穩(wěn)定。反應(yīng)結(jié)束后，于100℃沸水浴中滅酶10 min，2 000 r/min離心10 min，將上清液適當稀釋后測定其還原能力。

1.3.3 還原能力的測定

參考 Oyaizu 方法［14］，并略做修改。用pH 6.6 磷酸鹽緩沖液稀釋成不同濃度梯度，各取1 mL不同濃度的大米蛋白水解物，分別加入2.5 mL，pH 6.6磷酸鹽緩沖液，2.5 mL 1%鐵氰化鉀，混合后于50℃恒溫20 min，再加入 2.5 mL 10% 三氯乙酸，然后3 000 r/min離心10 min，取上層清液加2.5 mL蒸餾水和0.5 mL的0.1%FeCl3溶液。混勻后于700 nm處測定吸光度值。每一樣品進行3次重復(fù)。吸光值越高，表明酶解物的還原性越強。

1.3.4 酶解物分子質(zhì)量測定

采用高效液相色譜法分析。色譜柱TSK gel G2000 SWXL(7.8 ×300 mm);流動相為乙腈∶水∶三氟乙酸(TFA)=45∶55∶0.1，檢測波長 220 nm，柱溫25℃;流速1.0 mL/min，上樣量10μL。以標準品細胞色素C(M r 12 500)，抑肽酶(M r 6 500)，桿菌酶(M r 1 450)，乙氨酰－乙氨酰－酪氨酰－精氨酸(M r 451)和乙氨酰－乙氨酰－乙氨酸(M r 189)做分子質(zhì)量校正曲線。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

應(yīng)用SPASS軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果和討論

2.1 酶解條件的優(yōu)化

對3種不同高壓處理的大米蛋白分別進行不同底物濃度(A)、反應(yīng)溫度(B)、加酶量(C)和反應(yīng)時間(D)的單因素酶解試驗。在此基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗及相應(yīng)的因素和水平(表1)進行試驗，測定了不同壓力處理和酶解條件下酶解物的抗氧化活性(此處以還原力表示)。試驗結(jié)果如表2所示。

通過分析可知，經(jīng)過不同壓力處理的大米蛋白在相同酶解條件下制備的酶解物不僅還原力大小不同，而且隨著酶解條件的變化，還原力變化趨勢也有差異。極差分析表明，未經(jīng)高壓處理的大米蛋白酶解時，影響酶解物還原力大小的主次因素依次為CABD(即加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和底物濃度)，經(jīng)300、500 MPa高壓處理者的主次因素分別依次為CDAB、CABD。上述結(jié)果表明，高壓處理影響了大米蛋白的結(jié)構(gòu)，進而影響了它的酶解特性，因而相同條件下產(chǎn)生不同的多肽分子。這與文獻中其他蛋白高壓處理后的酶解特點有相似性［8，10］。

表1 因素和水平表

表2 正交試驗L9(34)及結(jié)果

統(tǒng)計結(jié)果顯示，未高壓處理大米蛋白的最佳酶解條件組合A2B2C2D3，即料液底物質(zhì)量分數(shù)5%，反應(yīng)溫度55℃、加酶量1%、反應(yīng)時間120 min，在此條件下制備的大豆蛋白酶解物的還原力達到0.125。同理，經(jīng)過300、500 MPa高壓預(yù)處理大米蛋白的酶解最佳條件組合分別為A2B1C2D3和A1B2C3D2，在該條件下的放大試驗的酶解物還原力結(jié)果分別為0.149和0.158，均高于正交試驗表中的相應(yīng)處理的最大值，表明優(yōu)化條件可靠。

2.2 分子質(zhì)量分布

為了探討大米蛋白肽抗氧化活性的分子基礎(chǔ)，將前述優(yōu)化條件下的酶解物用高效液相色譜進行分離(圖1)?？芍?，不同酶解物的分子質(zhì)量范圍差別不大，如最大分子質(zhì)量均為14.3 ku，最小分子質(zhì)量為300 u。不同分子質(zhì)量組分的相對含量卻明顯不同(表3)。未高壓處理的對照組中，10～15 ku、1～10 ku和1 ku以下等3段分子質(zhì)量組分所占比例分別為26.6%、46.9%、26.5%;300 MPa 預(yù)處理組中3 段分子質(zhì)量組分的質(zhì)量分數(shù)分別為16.5%、39.3%和44.2%;500 MPa組中的質(zhì)量分數(shù)分別為11.8%、33.1%和55.1%;其分子質(zhì)量大小與作者前期研究高壓處理更利于大米蛋白酶解的結(jié)論相吻合［12］。結(jié)合其還原力結(jié)果的分析表明，不同處理條件下大米蛋白酶解物的還原力大小與其分子質(zhì)量的分布之間有明顯的關(guān)聯(lián)性，即3種酶解條件下隨著小分子肽含量的比例增加，抗氧化活性也增大。這與文獻中其他蛋白的酶解現(xiàn)象有相似之處［15－16］。據(jù)報道，多種蛋白的酶解物中小分子質(zhì)量肽的抗氧化活性均比大分子組分的活性高，如小麥面筋蛋白中性蛋白酶物3 ku以下小麥肽［15］、大豆蛋白酶解物中5 ku以下的大豆肽［16］等組分具有較高的抗氧化活性。

圖1 不同壓力條件預(yù)處理大米蛋白酶解物的HPLC分析圖譜

表3 不同壓力預(yù)處理酶解物的分子質(zhì)量分布及其相對含量

3 結(jié)論

研究表明，高壓預(yù)處理大米蛋白有利于酶解產(chǎn)生更高抗氧化活性的大米肽，300 MPa和500 MPa處理者活性分別比未處理者提高19.2%和26.4%。當酶解條件變化時，不同壓力預(yù)處理者酶解物活性的變化趨勢也不一致，反映了其活性肽組分之間的差異。HPLC分析顯示，經(jīng)300 MPa和500 MPa高壓處理后的酶解物中分子質(zhì)量1 ku以下小肽的相對含量分別為44.2%和55.1%，而未高壓處理者該組分只有26.5%，可見，高壓處理有利于大米蛋白酶解產(chǎn)生小分子的活性肽。

［1］張美莉，侯文娟，楊立風(fēng).植物蛋白源生物活性肽的研究進展［J］.中國食物與營養(yǎng)，2010(11):33－36

［2］曹輝，馬海樂，曲文娟，等.大米蛋白的木瓜酶酶解及其水解物的抗氧化活性［J］.中國糧油學(xué)報，2009，24(7):10－13

［3］Morita T，Akira OH，Kaori T，et al，Cholesterol－ lowering effects of soybean，potato and rice proteins depend on their low methionine contents in rats fed a cholesterol－free purified diet［J］.The Journal of Nutrition，1997，127(3):470 －477

［4］張君慧，張暉，姚惠源.大米蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性及功能性質(zhì)研究［J］.食品工業(yè)科技，2008，29(5):73 －76

［5］王章存，申瑞玲，姚惠源.大米蛋白研究進展［J］.中國糧油學(xué)報，2004，19(2):11 －15

［6］Delgado A，Rauh C，Kowalczyk B，et al.Review of modelling and simulation of high pressure treatment of materials of biological origin［J］.Trends in Food Science ＆ Technology，2008，19:329 －336

［7］Marchal S，Torrent J，Masson P，et al.The powerful high pressure tool for protein conformational studies［J］.Brazilian Journal of Medical and Biological Research，2005，38:1175 －1183

［8］Quiros A，Chichon R，Recio I，et al.The use of high hydrostatic pressure to promote the proteolysis and release of bioactive peptides from ovalbumin［J］.Food Chemistry，2007，104:1734－1739

［9］Izquierdo FJ，Alli I，Gomez R.Effects of high pressure and microwave on pronase andα－chymotrypsin hydrolysis ofβlactoglobulin.Food Chemistry，2005，92:713 －719

［10］Zeece M，Huppertz T，Kelly A.Effect of high － pressure treatment on in－vitro digestibility ofβ －lactoglobulin.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2008，9:62－69

［11］Van der Plancken I，Maxime D，Indrawati，et al.Kinetic Study on the Changes in the Susceptibility of Egg White Proteins to Enzymatic Hydrolysis Induced by Heat and High Hydrostatic Pressure Pretreatment.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52:5621 －5626

［12］王章存，徐賢.超高壓處理對大豆蛋白酶解物的影響.中國釀造，2009，(2):132 －134

［13］王章存，崔勝文，趙學(xué)偉，等.高壓處理對大米蛋白溶解性及其分子特征的影響.中國糧油學(xué)報，2012，27(6):1－4

［14］Oyaizu M.Studies on products of browning reactions:antioxidant activities of products of browning reaction prepared from glucose a mine［J］.Japanese Journal of Nutrition，1986，44:307 －315

［15］林琳，崔鳳杰，閆桂強.不同分子質(zhì)量小麥面筋蛋白酶解多肽的分離及其抗氧化活性研究.糧食與飼料工業(yè)，2010，(8):34 －36

［16］鄧成萍，薛文通，孫曉琳.不同分子質(zhì)量段大豆多肽功能特性的研究.食品科學(xué)，2006，27(5):109－112