苓桂術甘湯對急性心肌梗死后心室重構(gòu)模型大鼠TNF-α的影響

王 靚， 侯曉燕， 黃金玲， 施 慧

(安徽中醫(yī)學院，安徽合肥230038)

急性心肌梗死 (acute myocardial infarction)后缺血性心肌病已經(jīng)成為慢性心力衰竭 (chronic heart failure)最常見的原因之一，急性心肌梗死后心室重構(gòu) (ventricular remodeling)是導致患者臨床癥狀不斷惡化，慢性心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理學基礎。既往研究顯示［1-2］，益氣溫陽、健脾化飲之經(jīng)典名方苓桂術甘湯能夠顯著抑制急性心肌梗死后6周慢性心力衰竭模型大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌及細胞因子過度表達，阻抑心室重構(gòu)，改善血流動力學指標，對急性心肌梗死所致慢性心力衰竭有積極的防治作用。本實驗觀察苓桂術甘湯對急性心肌梗死2周后心室重構(gòu)模型大鼠腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)的影響，探討其干預心室重構(gòu)的作用機制。

1 材料

1.1 實驗藥物 苓桂術甘湯 (茯苓12 g、桂枝9 g、白術9 g、甘草6 g)由亳州興和藥業(yè)有限公司提供，參考文獻［3］提取制成干浸膏粉末 (4.8 g生藥/g，其中桂皮醛9.945 mg/g，甘草酸14.71 mg/g);卡托普利為中美上海施貴寶制藥有限公司產(chǎn)品 (批號:011031)。

1.2 實驗動物 清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量0.18～0.22 kg，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(皖)2011-002。

1.3 主要試劑 Trizol Reagent、大鼠TNF-α熒光定量引物及探針均由invitrogen公司設計合成，批號:42801、NSO-512728-019;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑和Taq DNA聚合酶均由美國 Fermentas公司生產(chǎn)，批號為 00097559、00090703、00093869;熒光定量試劑盒由TaKaRa公司生產(chǎn)，批號BK7203;PVDF膜由美國millipore公司生產(chǎn)，批號K1JA0907MK;ECL試劑盒由美國pierce公司生產(chǎn)，批號MJ161901;TNF-α大鼠ELISA檢測劑盒由上海森雄科技實業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號20111105248。

1.4 主要儀器 ABI 2720型PCR儀和ABI 7500型RT-PCR儀均由美國ABI公司生產(chǎn);Bio-pro CN-UV型GSM凝膠圖像分析系統(tǒng)由美國Sim公司生產(chǎn);Multiskan MK2型酶標儀由芬蘭Labsystem公司生產(chǎn);Modulus多功能光度計由美國Turner Biosystems公司生產(chǎn);FR-180A型電泳槽由上海復旦生物實驗技術研究所生產(chǎn);DYY-Ⅱ型電泳儀由北京市六一儀器廠生產(chǎn);5417R型高速低溫離心機由德國Eppendorf公司生產(chǎn);NABILA 175型－80℃低溫冰箱由日本松下電器公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 急性心肌梗死模型復制 參考文獻 ［4］采用冠狀動脈結(jié)扎法。取雄性SD大鼠130只，乙醚麻醉后在呼吸機輔助下，無菌開胸，用6－0眼科縫合線在距左冠狀動脈根3 mm處結(jié)扎冠狀動脈左前降支，左心室顏色變淺，閉胸。術后大鼠心電圖Ⅱ?qū)?lián)S-T段抬高者視為造模成功，假手術組大鼠只穿線不結(jié)扎。

2.2 動物分組、給藥及方法 冠狀動脈結(jié)扎術后2周，將模型大鼠隨機分為5組 (每組12只):模型組，苓桂術甘湯小、中、大劑量組 (2.1、4.2、8.4 g生藥/kg，按體表面積法計算相當于臨床成人等效量的0.5、1、2倍)，卡托普利組 (4.375 mg/kg，按體表面積法計算相當于臨床成人等效量的1倍)，另設假手術組 (10只)。各組大鼠灌胃給藥，模型組和假手術組灌胃等容積蒸餾水，灌胃容積為10 mL/kg體質(zhì)量，每日1次，連續(xù)4周。

2.3 觀察指標及方法 連續(xù)灌胃處理4周后，各組大鼠腹腔注射烏拉坦5 mL/kg體質(zhì)量麻醉，背位固定，于大鼠腹主動脈取血，靜置4 h，低溫3 500 r/min離心10 min，分離血清，－20℃冰箱保存待測。采血后，無菌剖取心臟，冰生理鹽水沖洗，剪取左心室心肌組織 (含室間隔)，－80℃冰箱保存待測。

2.3.1 采用Western blot檢測大鼠心肌組織TNF-α蛋白取左心室心肌組織50 mg，添加RIPA細胞裂解液，制備心肌組織勻漿，離心取上清，按1∶4比例加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min，冷卻至室溫后，取蛋白樣品上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜 (β-actin蛋白分子量為43 kDa，TNF-α蛋白分子量為17 kDa)，加入Western封閉液室溫封閉2 h，按照說明書一抗孵育2 h，二抗孵育1.5 h，洗膜后使用ECL發(fā)光試劑盒檢測蛋白，結(jié)果采用Quantity one灰度分析軟件進行分析。

2.3.2 采用RT-PCR法檢測大鼠心肌TNF-αmRNA表達取左心室心肌組織50 mg，加入1 mol Trizol，分步經(jīng)三氯甲烷、異丙醇、75%乙醇處理后，抽提總RNA，加入80μL DEPC水，55℃ 10 min使RNA溶解，以actin為內(nèi)對照進行Real-time PCR反應。引物及探針序列如下:actin(上游5’-CGATGCCCTGAGGCTCTTT-3’、下 游 5’-TGGATGCCACAGGATTCCA-3’、探針 5’-CCAGCCTTCCTTCTT-3’)，TNF-α (上 游 5’-CTGGCCAATGGCATGGAT-3’、下 游5’-GGTACAGCCCATCTGCTGGTA-3’、探針 5’-TCAAAGACAACCAACTGGT-3’)。反應體系:2×Goldstar Taqman mixture10μL，上游引物 (10μmol/L)0.4μL，下游引物(10μmol/L)0.4 μL，探針 (10μmol/L)0.4μL，Template DNA 2μL，加無菌水至20μL。反應條件:95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40個循環(huán)。采用relative quantification study分析方法，相對表達量采用的指標為 2－ΔΔCt(Ct為循環(huán)值)。

2.3.3 采用ELISA法檢測大鼠血清TNF-α量 取分離凍存的大鼠血清按照試劑盒說明書方法步驟，用酶標儀檢測TNF-α 量。

3 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。連續(xù)性變量采用“均數(shù)±標準差 (±s)”表示，多樣本均數(shù)間比較采用One-Way ANOVA檢驗，P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 對心室重構(gòu)模型大鼠心肌組織TNF-α蛋白的影響連續(xù)處理4周，急性心肌梗死2周后心室重構(gòu)模型組大鼠左室心肌組織TNF-α蛋白量顯著升高，與假手術組比具有顯著性差異 (P＜0.01);苓桂術甘湯各劑量組及卡托普利組大鼠心肌組織TNF-α蛋白量顯著降低，與模型組比有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)，表明苓桂術甘湯能夠顯著地抑制模型大鼠心肌組織TNF-α蛋白的過度表達。結(jié)果見圖1、2。

圖1 對心室重構(gòu)模型大鼠心肌組織TNF-α蛋白的影響

圖2 各組大鼠左心室心肌組織TNF-α蛋白表達

4.2 對心室重構(gòu)模型大鼠心肌組織TNF-αmRNA表達的影響 連續(xù)處理4周，急性心肌梗死2周后心室重構(gòu)模型組大鼠左室心肌組織TNF-αmRNA表達顯著增強，與假手術組比較具有顯著性差異 (P＜0.01);苓桂術甘湯各劑量組及卡托普利組大鼠左室心肌組織TNF-αmRNA表達則明顯降低，與模型組比較具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)，表明苓桂術甘湯能夠顯著地抑制模型大鼠心肌組織TNF-αmRNA表達。結(jié)果見表1、圖3。

表1 對心室重構(gòu)模型大鼠心肌組織TNF-αm RNA表達的影響(±s，n=6)

表1 對心室重構(gòu)模型大鼠心肌組織TNF-αm RNA表達的影響(±s，n=6)

注:與假手術組比較，△△P＜0.01;與模型組比較，＊＊P ＜0.01。

組 別 劑量/(g·kg－1) Ct值假手術組 －32.034±0.118模型組 － 27.871±0.132△△苓桂術甘湯小劑量組 2.100 29.817±0.662＊＊苓桂術甘湯中劑量組 4.200 30.646±0.518＊＊苓桂術甘湯大劑量組 8.400 31.645±0.229＊＊卡托普利組 0.004 30.914±0.622＊＊

圖3 各組大鼠心肌組織TNF-αm RNA的相對表達量

4.3 對心室重構(gòu)模型大鼠血清TNF-α量的影響 連續(xù)處理4周后，急性心肌梗死2周后心室重構(gòu)模型組大鼠血清TNF-α量顯著增加，與假手術組比具有顯著性差異 (P＜0.01);苓桂術甘湯各劑量組及卡托普利組大鼠血清TNF-α量顯著降低，與模型組比有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)，表明苓桂術甘湯能夠顯著地降低模型大鼠血清TNF-α量。結(jié)果見表2。

表2 對心室重構(gòu)模型大鼠血清TNF-α量的影響(±s)

表2 對心室重構(gòu)模型大鼠血清TNF-α量的影響(±s)

注:與假手術組比較，△△P＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組 別 動物/只劑量/(g·kg－1)TNF-α/(ng·L－1)假手術組10 － 97.101±13.564模型組 8 － 178.129±24.160△△苓桂術甘湯小劑量組 9 2.100 153.346±14.072*苓桂術甘湯中劑量組 10 4.200 128.640±19.704＊＊苓桂術甘湯大劑量組 10 8.400 139.939±21.282＊＊卡托普利組 10 0.004 135.036±9.856＊＊

5 討論

慢性心力衰竭臨床表現(xiàn)復雜，屬祖國醫(yī)學“心悸”、“痰飲”、“水腫”等范疇，系本虛標實之證?！靶呐K屬火，為陽中之太陽。上居于胸，秉火陽之權(quán)威，震懾下焦水寒之邪不敢越雷池一步”?！靶年栆惶?，則坐鎮(zhèn)水寒之權(quán)威失勢，下焦水寒陰氣便有上乘之機”，乃有“心水”發(fā)生［5］。陽虛飲停日久則致血行瘀滯不利，久者歷歲，漸見心悸怔忡，少尿水腫等虛、痰、瘀兼夾之候。其病理重點當責之于心之陽氣虛衰，心陽氣虛是本病的發(fā)病關鍵，是貫穿其始終的基本病理，以溫陽益氣為首要［6］。苓桂術甘湯是漢《傷寒雜病論》溫心陽化水飲之代表方，由桂枝、茯苓、白術和甘草組成，本方內(nèi)寓桂枝甘草湯，此乃仲景用以溫心陽者，柯琴《傷寒附翼》視之為“溫心陽之峻劑”;桂苓相輔，則溫陽化氣，消飲寧心;白術協(xié)茯苓，培土以制水。配伍謹嚴，臨床效著［5，7-8］。

現(xiàn)代研究表明心臟受損后神經(jīng)內(nèi)分泌因子網(wǎng)絡激活，誘導心室重構(gòu)的發(fā)生，并最終導致心功能惡化，進展為慢性心力衰竭。TNF-α作為細胞因子網(wǎng)絡的關鍵因子之一，在心肌受損后的心室重構(gòu)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［9］。TNF-a是由激活的巨噬細胞分泌的一種具有多種生物學效應的細胞因子，促進炎性細胞的聚集和炎性遞質(zhì)的釋放，通過心肌局部自分泌和旁分泌參與對心肌細胞及心肌間質(zhì)細胞的生長和分化的調(diào)控［10］。一方面通過促進IL-1、IL-6和hs-CRP等細胞因子的表達，調(diào)控炎癥的發(fā)生與發(fā)展［11-12］，另一方面通過激活Caspase參與心肌細胞凋亡的調(diào)控，同時還通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶參與心肌纖維化的調(diào)控［13］，還可通過刺激心肌細胞膜IκB降解，進而激活NK-κB表達，導致依賴NK-κB激活的相關基因轉(zhuǎn)錄并與核DNA結(jié)合增加，進一步誘導心肌細胞壞死、凋亡［14］。因此，TNF-α在心肌損傷后發(fā)揮著刺激心肌細胞肥大，促進心肌細胞壞死，誘導心肌細胞凋亡，調(diào)節(jié)心肌細胞外基質(zhì)改變，影響膠原的合成促進基質(zhì)分解等作用，最終導致心臟結(jié)構(gòu)破壞、功能受損，促進心室重構(gòu)及心衰發(fā)生、發(fā)展［15］。

2009 年美國心臟病學會和心臟學會聯(lián)合發(fā)布的《心力衰竭指南》指南強調(diào)早期干預對減少心衰發(fā)生、改善患者預后以及降低整體醫(yī)療成本有著積極的促進作用。本實驗在既往研究基礎上，觀察苓桂術甘湯對急性心肌梗死后早期干預對慢性心力衰竭的防治作用及機制。研究結(jié)果顯示，在急性心肌梗死后2周用苓桂術甘湯連續(xù)干預4周，模型大鼠心肌組織TNF-α、TNF-αmRNA的表達及血清TNF-α量均明顯降低，表明抑制炎癥因子TNF-α過度激活是該方阻抑心室重構(gòu)、防治心力衰竭作用的重要機制之一。關于苓桂術甘湯對其他炎癥因子及神經(jīng)內(nèi)分泌因子的調(diào)控作用已另文發(fā)表或正待發(fā)表。

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