阿司匹林與氯吡格雷對小鼠血小板P-選擇素抑制作用的比較☆

林志堅郭淮蓮孫凱韓晶巖

阿司匹林和氯吡格雷是臨床上最常用的抗血小板藥物，已經(jīng)被寫入各國缺血性腦卒中的防治指南[1,2]。阿司匹林與氯吡格雷抗血小板作用的比較多見于臨床試驗中[3]，觀察指標(biāo)多為新發(fā)缺血事件的發(fā)生率。目前國內(nèi)外尚未見基于血小板功能實驗室指標(biāo)的比較這兩種藥物藥效的報道。血小板膜表達P-選擇素是血小板活化的重要標(biāo)志，本研究擬利用流式細(xì)胞技術(shù)測定血小板膜P-選擇素陽性率的方法，比較阿司匹林和氯吡格雷對小鼠血小板活化的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 雄性昆明小鼠（8周齡，體質(zhì)量35～40g），清潔級，40只，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，隨機分為4組：對照組，阿司匹林組、氯吡格雷組、阿司匹林+氯吡格雷組，每組10只。其中對照組血標(biāo)本又分為陰性對照組和膠原活化組。

1.2 實驗方法

1.2.1 灌胃 將阿司匹林、氯吡格雷、阿司匹林+氯吡格雷分別溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉（Carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）溶液配制成相應(yīng)的混懸液。對照組小鼠給予0.5%CMC-Na溶液（0.01 mL/g）灌胃；阿司匹林組小鼠給予阿司匹林混懸液15 mg/kg灌胃[按人與動物用藥劑量換算公式[4]：小鼠劑量（mg/kg）=9.01×成人阿司匹林劑量（100 mg）/成人體重（60 kg）計算得出]；氯吡格雷組小鼠給予氯吡格雷混懸液11.26 mg/kg灌胃[計算方法同上：小鼠劑量（mg/kg）=9.01×成人氯吡格雷劑量（75 mg）/成人體重（60 kg）]；阿司匹林+氯吡格雷組小鼠給予阿司匹林+氯吡格雷混懸液（15 mg/kg，11.26 mg/kg）灌胃。灌胃每日1次，共7d。

1.2.2 采血 第7d灌胃后1h采用眼球摘除法取全血于3.8%枸櫞酸鈉抗凝EP管中。

1.2.3 膠原激活 取對照組小鼠全血10μL加入生理鹽水10μL（分別取2管），混勻，37℃孵育15 min作為陰性對照組；另取對照組小鼠全血10μL加入100μg/mL膠原10μL（美國Sigma公司產(chǎn)品）（分別取2管），混勻，37℃孵育15min作為膠原活化組。其余各組取全血10μL分別加入100μg/mL膠原10μL（分別取2管），混勻，37℃孵育15min。

1.2.4 流式細(xì)胞檢測 在上述經(jīng)過處理的標(biāo)本中，對照管加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記倉鼠抗小鼠CD61單克隆抗體（CD61-FITC）1 μL，試驗管加入抗小鼠CD61-FITC 1 μL、藻紅蛋白標(biāo)記小鼠抗小鼠CD62P單克隆抗體（CD62P-PE）2μL（按照說明書操作）?；靹蚴覝乇芄夥跤?0 min，然后再加入1 mL冷的磷酸緩沖液（PBS）。采用流式細(xì)胞儀（美國BD FACSCalibur公司）檢測，以CD61-FITC和側(cè)散射光散點圖設(shè)血小板門，測定血小板膜CD62P（P-選擇素）表達陽性百分率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以(±s)表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），組間均數(shù)比較采用LSD-t檢驗，檢測水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

陰性對照組、膠原活化組、阿司匹林組、氯吡格雷組、阿司匹林+氯吡格雷組血小板膜P-選擇素陽性率見表1。

表1 各組血小板膜P-選擇素陽性率比較（±s，%）

表1 各組血小板膜P-選擇素陽性率比較（±s，%）

1)：與對照組比較P＜0.05；2)：與膠原活化組比較P＜0.05；3)：與阿司匹林組比較P＜0.05；4)：與氯吡格雷組比較P＜0.05；5)：與阿司匹林組比較P＞0.05

組別陰性對照組膠原活化組阿司匹林組氯吡格雷組阿司匹林＋氯吡格雷組n 10 10 10 10 10 P－選擇素9.94%±1.32%54.14%±6.37%1)41.89%±3.26%2)48.10%±2.24%2)3)40.69%±7.44%2)4)5）

3 討論

抗血小板藥物在非心源性缺血性腦卒中和TIA的預(yù)防和治療中起重要作用，阿司匹林和氯吡格雷是臨床上應(yīng)用最廣泛的抗血小板藥物，這兩種藥物療效的直接比較見于多個臨床試驗中，如CAPRIE試驗[3]，研究發(fā)現(xiàn)氯吡格雷與阿司匹林相比可顯著減少新發(fā)缺血事件（聯(lián)合終點包括非致死性心梗、缺血性卒中或血管死亡）的發(fā)生率；MATCH試驗[5]發(fā)現(xiàn)，近期發(fā)生短暫性腦缺血發(fā)作或缺血性腦卒中患者聯(lián)合使用氯吡格雷和阿司匹林與服用氯吡格雷和安慰劑相比，前者并未減少主要終點事件(心肌梗死、缺血性卒中、血管性死亡事件及因急性缺血事件再住院)的發(fā)生，而3個月后明顯增加了出血的風(fēng)險。目前國內(nèi)外尚未見到基于血小板功能實驗室指標(biāo)的比較這兩種藥物藥效的報道。

臨床上藥物的作用可能受患者年齡、病情、合并癥、依從性、合并用藥等因素的干擾，動物實驗可避免上述因素的干擾。傳統(tǒng)用于評價抗血小板藥效的血小板聚集率檢測重復(fù)性欠佳，標(biāo)本準(zhǔn)備過程繁瑣、費時[6]。P-選擇素主要存在于血小板α顆粒內(nèi)，血小板活化后，α顆粒與血小板質(zhì)膜融合，P-選擇素表達在血小板表面[7]，P-選擇素與其配體結(jié)合后起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，活化靶細(xì)胞或改變其功能狀態(tài)，從而介導(dǎo)白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞-血小板間反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織損傷[8]。血小板膜P-選擇素表達是血小板活化的重要標(biāo)志，采用熒光抗體標(biāo)志P-選擇素，利用流式細(xì)胞技術(shù)可比較準(zhǔn)確的檢測血小板膜P-選擇素陽性率。因此，本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測血小板膜P-選擇素陽性率，進而比較抗血小板藥物的作用。

國內(nèi)外多個有關(guān)抗血小板藥物的研究[9,10]均采用服藥7d后取血測血小板功能。研究表明[11]，阿司匹林口服經(jīng)胃腸道完全吸收后迅速降解為水楊酸，反復(fù)用藥后水楊酸鹽的半衰期可維持5-18h，其對血小板的抑制在1～4 d達到穩(wěn)態(tài)。氯吡格雷75mg每日一次重復(fù)給藥，從第1 d開始明顯抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，抑制作用逐步增強并在3～7 d達到穩(wěn)態(tài)。因此，本研究選擇在給藥7 d后采血。

本研究發(fā)現(xiàn)，加入膠原后，血小板膜P-選擇素陽性率明顯升高，提示膠原可刺激血小板活化。膠原是啟動血小板粘附、聚集過程強有力的血管壁成份。血小板有2個受體在血小板－膠原相互作用起重要作用，即糖蛋白Ⅵ（GPⅥ）和整合素α 2β1。血小板特異性GPⅥ（62 kDa）是免疫球蛋白超家族的一個成員，其與膠原的親和力低，不能單獨介導(dǎo)穩(wěn)定的血小板粘附，但對血小板穩(wěn)定的粘附到膠原上起關(guān)鍵作用，因為它通過結(jié)合的FcRγ鏈誘導(dǎo)強大的信號途徑；整合素α2β1經(jīng)過活化后由低親和力構(gòu)象轉(zhuǎn)化為高親和力構(gòu)象，膠原結(jié)合到整合素α2β1促進血小板活化和緊密粘附途徑的下游步驟的進行。

阿司匹林通過不可逆的抑制環(huán)氧化酶-1（cyclooxygenase-1,COX-1），使花生四烯酸不能合成前列腺素，血栓素A2(thromboxane A2,TxA2)合成受阻，從而抑制血小板的聚集；氯吡格雷是一種噻吩吡啶類化合物，選擇性抑制二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）與血小板膜ADP受體結(jié)合及繼發(fā)的ADP介導(dǎo)的糖蛋白GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物的活化，從而抑制血小板聚集。氯吡格雷還能阻斷其它激動劑通過釋放ADP引起的血小板聚集。許多研究[12]采用ADP激活血小板釋放P-選擇素，而本研究選擇的膠原引起的P-選擇素的表達不是阿司匹林、氯吡格雷直接藥理作用的靶點，因此可以客觀的比較阿司匹林、氯吡格雷對血小板活化的抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)：①阿司匹林、氯吡格雷及阿司匹林+氯吡格雷可以抑制膠原引起的血小板膜P-選擇素的表達，提示上述藥物均可以抑制膠原引起的血小板活化。②阿司匹林對膠原引起的血小板活化的抑制作用較氯吡格雷強。提示阿司匹林對血小板活化的抑制作用可能優(yōu)于氯吡格雷，這與某些臨床試驗結(jié)果存在差異[3]，可能的原因是本研究以膠原誘導(dǎo)的血小板膜P-選擇素表達為觀察指標(biāo)，而臨床試驗隨訪新的缺血事件的發(fā)生；其次，臨床試驗中有各種臨床因素的影響；另外，本研究觀察時間短、為一周，而臨床試驗隨訪時間長，多在半年或1年以上[3,13]。③阿司匹林+氯吡格雷對膠原誘導(dǎo)的血小板活化的抑制作用與單用阿司匹林相當(dāng)。這一點與臨床試驗結(jié)果一致。臨床研究提示聯(lián)合使用阿司匹林+氯吡格雷比單獨使用阿司匹林沒有顯著獲益，而雙聯(lián)抗血小板治療出血的風(fēng)險高于單獨使用阿司匹林或氯吡格雷[14]。

本研究的不足之處在于僅測定P-選擇素，而未檢測血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa纖維蛋白原受體。靜息血小板表面的GPⅡb/Ⅲa不能結(jié)合纖維蛋白原，當(dāng)血小板活化后，隱蔽狀態(tài)的GPⅡb/Ⅲa表達于血小板表面，同時使GPⅡb/Ⅲa的結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象及周圍微環(huán)境的改變，使纖維蛋白原受體結(jié)合部位暴露，獲得受體活性，并與之結(jié)合，引起血小板聚集。GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原的結(jié)合是血小板聚集的最后通路[15]。GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原結(jié)合，引起血小板聚集，促進血栓形成，在腦缺血缺氧性損傷起重要的作用。有研究表明【16】，GPⅡb/Ⅲa纖維蛋白原受體與急性腦梗死患者病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。今后的研究將完善這個指標(biāo)的檢測。

綜上所述，膠原可誘導(dǎo)小鼠血小板膜P-選擇素陽性率升高；阿司匹林、氯吡格雷及阿司匹林+氯吡格雷能抑制膠原誘導(dǎo)的血小板活化，在預(yù)防和治療非心源性缺血性腦卒中和TIA起重要作用；阿司匹林對膠原誘導(dǎo)的小鼠血小板活化的抑制作用較氯吡格雷強；阿司匹林+氯吡格雷對膠原引起的小鼠血小板活化的抑制作用與單用阿司匹林相當(dāng)。阿司匹林和氯吡格雷對血小板活化抑制作用的比較仍需擴大樣本量進一步研究。

[1]中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會腦血管病學(xué)組缺血性腦卒中二級預(yù)防指南撰寫組.中國缺血性腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作二級預(yù)防指南2010[J].中華神經(jīng)科雜志2010,43（2）：154－160.

[2]Furie KL,Kasner SE,Adams RJ,et al.Guidelines for the prevention of stroke in patients with stroke or transient ischemic attack:a guideline for healthcare professionals from the american heart association/american stroke association[J].Stroke,2011,42(1):227－276.

[3]CAPRIE Steering Committee.A randomised,blinded,trial of clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events(CAPRIE)[J].Lancet,1996,348(9038):1329－1339.

[4]趙偉,孫國志.不同種實驗動物間用藥量換算[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2010,22(5):52－53.

[5]Diener HC,Bogousslavsky J,Brass LM,et al.Aspirin and clopidogrel compared with clopidogrel alone after recent ischaemic stroke or transient ischaemic attack in high－risk patients(MATCH):randomised,double－blind,placebo－controlled trial[J].Lancet,2004,364(9431):331－337.

[6]Harrison P.Assessment of platelet function in the laboratory[J].Hamostaseologie,2009,29(1):25－31.

[7]Yamazaki M,Uchiyama S,Iwata M.Measurement of platelet fibrinogen binding and p－selectin expression by flow cytometry in patients with cerebral infarction[J].Thromb Res,2001,104(3):197－205.

[8]Htun P,Fateh－Moghadam S,Tomandl B,et al.Course of platelet activation and platelet－leukocyte interaction in cerebrovascular ischemia[J].Stroke,2006,37(9):2283－2287.

[9]金英玉，辛?xí)悦簦瑥堅破?，?反復(fù)腦梗死患者服阿司匹林后血小板聚集功能的變化[J].中國實驗診斷學(xué),2006,10(3):269－270.

[10]Berrouschot J,Schwetlick B,von Twickel G,et al.Aspirin resistance in secondary stroke preverntion[J].Acta Neurol Scand 2006,113(1):31－35.

[11]郎森陽.抗血小板藥物[M]//匡培根.神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物治療學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：137－140.

[12]Eriksson AC,Jonasson L,Lindahl TL,et al.Static platelet adhesion,flow cytometry and serum TXB2 levels for monitoring platelet inhibiting treatment with ASA and clopidogrel in coronary artery disease:a randomised cross－over study[J].J Transl Med,2009,7:42.

[13]Hankey GJ,Hacke W,Easton JD,et al.Effect of clopidogrel on the rate and functional severity of stroke among high vascular risk patients:a prespecified substudy of the Clopidogrel for High Atherothrombotic Risk and Ischemic Stabilization,Management and Avoidance(CHARISMA)trial[J].Stroke,2010,41(8):1679－1683.

[14]Ruland S.Safety of clopidogrel and aspirin for stroke prevention:implications of the CHARISMA trial[J].Drug Saf,2008,31(6):449－458.

[15]Schneider DJ.Anti－platelet therapy:glycoprotein IIb－IIIa antagonists[J].Br J Clin Pharmacol,2011,72(4):672－682.

[16]張炘，段傳志，李鐵林，等.血小板活化特異性標(biāo)志物PAC－1和CD62p與急性腦梗死病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2011,37(11):698－701.