腫瘤壞死因子基因多態(tài)性與男性青少年品行障礙的關(guān)聯(lián)☆

劉麗禹順英邵陽(yáng)張燃謝斌

大量研究表明，遺傳因素在品行障礙（Conduct Disorder，CD）的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[1-2]，而且遺傳導(dǎo)致的神經(jīng)發(fā)育異?？赡芘cCD的核心癥狀如沖動(dòng)、暴力攻擊等密切相關(guān)。2011年Dick等[3]對(duì)CD者癥狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白7（C1QTNF7）基因中的rs16891867、rs7950811、rs11838918、rs1861046 和rs4698107與 CD 癥狀相關(guān)（P<5×10-8）。目前C1QTNF7的作用機(jī)制并不明確，可能與血漿中腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）水平有關(guān)[3]。既往研究顯示TNF水平與生活事件應(yīng)激反應(yīng)、HPA軸調(diào)節(jié)及防御方式有關(guān)[4-6]，而應(yīng)激不僅與CD的形成有關(guān)，而且應(yīng)激所致的HPA軸功能改變也與青少年暴力等行為問題存在密切聯(lián)系。但目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏此基因與CD的關(guān)聯(lián)研究，故本研究對(duì)中國(guó)漢族男性青少年CD患者中C1QTNF7基因多態(tài)性是否與CD的發(fā)生相關(guān)進(jìn)行探討。此外，大量研究表明，CD與注意缺陷多動(dòng)障礙（Attention Deficit Hyperactivity Disorder，ADHD）共病率較高，可能存在共同的遺傳基礎(chǔ)[7]，因此本研究又根據(jù)患者是否共病ADHD分組，進(jìn)一步探討其共病機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 來(lái)自因犯罪而新入上海未成年人管理教養(yǎng)所（以下簡(jiǎn)稱少管所）的男性青少年，案件性質(zhì)包括搶劫、傷害、擾亂治安、盜竊和詐騙等。符合《美國(guó)精神障礙分類與診斷統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四版》（The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，DSM-IV）CD的診斷標(biāo)準(zhǔn)；排除嚴(yán)重的心臟疾病、肝、腎功能損害及血液疾病者、嚴(yán)重消化系統(tǒng)疾病者、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良者，以及合并有明顯神經(jīng)、精神疾病史者。符合標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)象在取得本人以及法定監(jiān)護(hù)人的知情同意之后正式入組。由兩名主治以上醫(yī)師對(duì)CD患者明確診斷，并由專職研究員使用國(guó)際神經(jīng)精神科簡(jiǎn)式訪談問卷（mini-mental state examination，MINI）5.0.0中文版復(fù)核診斷。共72例CD患者符合以上標(biāo)準(zhǔn)并最終入組，年齡16～18歲，平均（17.07±0.85）歲。根據(jù)DSM-IV中ADHD的診斷標(biāo)準(zhǔn)將CD組又再分為ADHD組（22例）和非ADHD組（50例），平均年齡分別為17.12歲和17.05歲，兩組年齡比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=0.484,P=0.63）。

對(duì)照組來(lái)自本市某區(qū)健康體檢站體檢人群。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)CD的高峰年齡一般認(rèn)為是15～18歲[8]，18歲之后性格特質(zhì)穩(wěn)定，CD行為發(fā)生率顯著減少或消失。故對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為年齡18歲以上，并且18歲之前無(wú)CD無(wú)ADHD行為的漢族男性健康體檢者。體檢時(shí)由專職研究員使用MINI問卷5.0.0中文版進(jìn)行篩查。排除標(biāo)準(zhǔn)同病例組。共收集178名對(duì)照，年齡18～60歲，平均（24.24±7.34）歲，與CD組的年齡存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=12.77，P<0.05）。

所有研究對(duì)象對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 因在少管所內(nèi)采集靜脈血存在一定困難，故CD組采用口腔黏膜拭子采集黏膜細(xì)胞，用特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱試劑盒（美國(guó)ABI公司訂制）提取DNA，凍存于－80℃冰箱待測(cè)。對(duì)照組采集靜脈血5mL，EDTA抗凝，用酚氯仿法在當(dāng)天或次日提取DNA，凍存于－80℃冰箱待測(cè)。

1.2.2 基因多態(tài)性檢測(cè) 本研究根據(jù)全基因組關(guān)聯(lián)研究（Genome Wide Association Studies，GWAS）陽(yáng)性結(jié)果，以及HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中中國(guó)北京漢族（Chinese Han origin in Beijing，CHB）數(shù)據(jù)，根據(jù)最小等位基因頻率（Minor Allele Frequency，MAF）＞10%，連鎖不平衡系數(shù)（R2）＞0.8，進(jìn)行篩選，最終選擇rs4698107和rs16891867兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

使用SnaPshot法進(jìn)行基因分型，rs4698107PCR引物 F-CAGGGCTCCCACTGATTCTA，R-CGCAGATGCACTTGTGTCTT，合成片段589bp，延伸引物為ATTGTCTTCCATGAAACCAGTCCCTGGTGCCAAAACGTTC。rs16891867 PCR引物F-CCACAACCCAGTTAAAAGAGG，R-TTAAAACAGTGTCTTTGGAGTCAA，合成片段381bp，延伸引物為AATGACACCGAAAAAACAGCAGAAAATTGTAAGACCTACTCTGTGCTGAGAAAAT。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為15μL，DNA（原液）2μL，dNTP Mixture（2.5mM）0.5μL，10 × PCR Buffer（Takara）1.5μL，Taq HS（Takara）（5U/μL）0.15μL，引 物（0.2μL+0.2μL）（10pmol/μL），以滅菌水補(bǔ)足到15μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 2min（95℃ 40s＋60℃30s＋72℃ 1min 30s）×35cycle 72℃ 8min。將 PCR產(chǎn)物取5μL進(jìn)行2.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物純化：10μL SAP 酶（Takara）（1U/μL）1μl，ExonI酶（Takara）（5U/μL）1μL，反應(yīng)溫度為 37℃ 80min和85℃15min。延伸反應(yīng)反應(yīng)體系15μL；反應(yīng)溫度96℃ 1min（96℃ 10s＋50℃ 5s＋60℃ 30s）×28cycle。純化：PCR 產(chǎn)物 10μL，SAP酶（Takara）（1U/μL）1μL，反應(yīng)溫度：37℃ 80min，75℃ 15min。ABI 3130XL測(cè)序儀測(cè)序，原始數(shù)據(jù)分析采用Gene-Mapper 4.1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0和SHEsis在線軟件（http://analysis2.bio-x.cn/myAnalysis.php）進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析單位點(diǎn)基因型分布是否符合Hardy-weinberg平衡法則，χ2檢驗(yàn)用于比較各位點(diǎn)基因型、等位基因頻率在病例組和對(duì)照組間的分布差異。運(yùn)用SHEsis在線軟件構(gòu)建單倍體進(jìn)行單體型分析，單體型是指位于一條染色體特定區(qū)域的一組相互關(guān)聯(lián)并傾向于以整體遺傳給后代的單核苷酸多態(tài)的組合，單體型分析是根據(jù)實(shí)際數(shù)據(jù)推斷預(yù)測(cè)的結(jié)果，結(jié)果使用期望值表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。將CD組被試根據(jù)是否存在ADHD分亞組，用χ2檢驗(yàn)比較三組各位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率，兩兩比較采用Bonferroni法調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)，調(diào)整后α為0.017。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 經(jīng)χ2檢驗(yàn)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）rs4698107和rs16891867在CD組（χ2分別為0.44和0.92）以及對(duì)照組（χ2分別為0.06和0.08）均符合Hardy-weinberg平衡定律（均P>0.05），CD組和對(duì)照組具有群體代表性。

2.2 CD組與對(duì)照組C1QTNF7基因兩位點(diǎn)多態(tài)性分析 CD組中rs4698107位點(diǎn)A等位基因頻率高于對(duì)照組（χ2=5.027，P=0.025），OR 值為 1.72，95%CI為（1.07，2.76），基因型分布在兩組中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=8.051，P=0.018）。rs16891867的等位基因頻率（χ2=0.625，P>0.05）和基因型（χ2=1.123，P>0.05）分布在兩組中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。兩組兩位點(diǎn)單體型分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=3.690，P>0.05）。見表2。

表1 CD組與對(duì)照組C1QTNF7兩位點(diǎn)基因頻率、基因型的比較（n，%）1)

表2 CD組與對(duì)照組單體型rs4698107-rs16891867的比較1)

2.3 ADHD組、非ADHD組及對(duì)照組兩位點(diǎn)多態(tài)性分析 將CD組被試根據(jù)是否存在ADHD分亞組，比較三組各位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率。三組中rs4698107等位基因分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=5.637，P>0.05）；基因型分布存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=12.842，P=0.012），進(jìn)一步兩兩比較，ADHD組與對(duì)照組間基因型分布存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=11.544，P=0.003）。rs16891867位點(diǎn)等位基因頻率和基因型在三組中的分布均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見表3。

表3 兩個(gè)SNP基因頻率與基因型的比較（n，%）1)

3 討論

品行障礙（CD）是臨床上常見的一類破壞性行為障礙，有關(guān)的病因?qū)W研究提示CD具有遺傳基礎(chǔ)，遺傳度達(dá)40%～50%[1]。目前對(duì)CD候選基因的研究主要包括單胺氧化酶A（monoamine oxidase A，MAOA）、5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（serotonin transporter,5-HTT）、兒茶酚胺甲氧基轉(zhuǎn)移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）等[9]，但研究結(jié)果并不一致，因此有必要對(duì)CD可能的遺傳位點(diǎn)繼續(xù)探討。

C1QTNF7基因位于4號(hào)染色體短臂15.3區(qū)。GWAS研究發(fā)現(xiàn)，C1QTNF7中5個(gè)SNP與CD癥狀相關(guān)（P<5×10-8），此基因多個(gè)SNP與CD有顯著相關(guān)性，而且多位點(diǎn)間完全連鎖不平衡程度不高[3]。因此有理由相信C1QTNF7基因多態(tài)性與CD癥狀存在相關(guān)性，但國(guó)內(nèi)外未有研究報(bào)道證實(shí)。C1QTNF7影響CD的機(jī)制仍然不明確，可能與血漿中TNF水平有關(guān)。眾多研究表明，TNF水平的增高與敵意、憤怒和攻擊情緒密切相關(guān)[10-11]，而攻擊行為是CD的主要癥狀之一，因此腫瘤壞死因子相關(guān)基因可能會(huì)影響CD疾病的發(fā)生。本研究對(duì)男性青少年CD患者的C1QTNF7基因中rs16891867、rs4698107兩位點(diǎn)SNPs進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，CD組中rs4698107位點(diǎn)A等位基因頻率高于對(duì)照組，基因型分布在兩組間也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs16891867的等位基因頻率和基因型在兩組比較中無(wú)差異，與之前GWAS研究不一致?？赡艿脑蚴牵珼ick等[3]的GWAS研究選取的人群是物質(zhì)依賴的患者，雖然物質(zhì)依賴與CD共病率較高，但其癥狀表現(xiàn)畢竟只有交叉而無(wú)必然的重疊，因此不一定存在完全相同的患病基因。同時(shí)，CD發(fā)生的具體機(jī)制不明確，環(huán)境、心理社會(huì)因素也起到重要作用，而且本研究對(duì)象都是青少年男性CD患者，而且樣本量較小，因此可能會(huì)有一定的偏倚結(jié)果產(chǎn)生。

當(dāng)對(duì)CD組按是否共患多動(dòng)障礙（ADHD）分組時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs4698107位點(diǎn)基因型在三組比較中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)伴有ADHD的CD患者基因型與對(duì)照組比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而不伴有ADHD的CD患者與對(duì)照組之間沒有發(fā)現(xiàn)差異。臨床資料顯示10歲以前的兒童中，ADHD和CD共患病率高達(dá)54%[12]，兩種疾病間可能存在共同的遺傳機(jī)制，含有rs4698107 A等位基因的青少年可能更容易共病，而在不伴有ADHD的CD患者中沒有發(fā)現(xiàn)差異，可能與分亞型后各組樣本量減少，導(dǎo)致檢驗(yàn)效能下降而出現(xiàn)假陰性有關(guān)。

本研究也存在一定的局限性。首先，因樣本收集有一定的難度，樣本量較小，結(jié)果的可靠性還需大樣本研究的驗(yàn)證。而且本研究對(duì)象來(lái)自因犯罪而新入少管所的男性青少年，樣本有一定局限性，未考慮疾病嚴(yán)重程度、犯罪性質(zhì)及人格特質(zhì)等[13]，所以本研究結(jié)果可為將來(lái)的研究提供一個(gè)新的研究方向。其次，對(duì)于ADHD的診斷訪談是基于研究對(duì)象本人，未訪談患兒家長(zhǎng)，因此ADHD有可能漏診。綜上所述，本研究?jī)H為初步結(jié)果，具有一定的參考價(jià)值，今后有待于更多臨床試驗(yàn)的進(jìn)一步研究。

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