Arp2/3復合物表達沉默對膠質瘤細胞侵襲和遷移的影響☆

劉志峰楊學軍劉彬陳聰任炳成王壘壘趙愷于圣平明浩朗朱蒙

多形性膠質母細胞瘤（gliobiastoma multiforme,GMB）患者的5年生存率仍然不到10%，對于年長的患者來說生存率更低[1]。對周圍腦組織的廣泛浸潤以及復發(fā)是惡性膠質瘤難以根治的原因。膠質瘤細胞的侵襲和遷移是惡性膠質瘤不斷進展的關鍵環(huán)節(jié)，而腫瘤細胞前端片狀偽足的形成在細胞運動過程中的作用至關重要。肌動蛋白相關蛋白2/3復合物(actin-related protein 2/3 complex,Arp2/3 complex)能夠綁定到肌動蛋白絲的側面誘導肌動蛋白分支的形成，隨著肌動蛋白分支的延長,其與對應的細胞質膜形成片狀偽足[2]。在一些腫瘤組織和侵襲性細胞中，Arp2/3 mRNA及其蛋白水平表達發(fā)生了上調。在小細胞肺癌中Arp2/3的表達情況與癌癥的預后呈負相關。有研究發(fā)現(xiàn)通過RNA干擾Arp2/3活性之后可以顯著抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲能力[3]。本研究利用RNA干擾技術沉默Arp3表達，從而抑制Arp2/3的活性，觀察其對膠質瘤細胞遷移和侵襲行為的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象 細胞系為人膠質瘤U251細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。siRNA寡核苷酸購自上海吉瑪制藥公司。實驗所需引物購自大連TaKaRa公司。RIPA裂解液購自江蘇碧云天生物技術研究所。小鼠抗人GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。逆轉錄試劑盒購自北京天根公司。4%多聚甲醛購自索來寶公司。小鼠抗人Arp3單克隆抗體購自美國Abcam公司。Lipofectin-2000TM、TRI zol、兔抗人 p34抗體、Alexa Fluor標記的山羊抗兔熒光二抗及羅丹明鬼筆環(huán)肽購自美國Invitrogen公司。Marigel基質膠購自美國BD公司。Transwell板購自美國corning公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 人膠質瘤U251細胞使用含10%新生胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，內加青霉素100U/mL，鏈霉素100g/L，置于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。實驗分為3組：siRNA-Arp3組（轉染siRNA-Arp3干擾片段）、siRNA-NC組（轉染對照siRNA片段）、siRNA-N組（空白對照組）。轉染所需寡核苷酸序列分別為siRNA-Arp3:5’-UCAUCCCUUCCUGUAUUGCUAUUAA-3’及siRNA-NC：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。

1.3 逆轉錄酶-多聚酶鏈反應（reverse transrip?tase-polymerase chain reaction,RT-PCR）檢測Arp3 mRNA表達水平 按Trizol試劑盒說明書分別提取轉染后48 h siRNA-Arp3組、siRNA-NC組和siRNA-N組細胞的總RNA。RT-PCR反應按照反轉錄PCR試劑盒說明書進行操作。PCR擴增條件為：94℃預變性 5 min；94℃ 30 s，退火 49℃30 s，延伸72℃ 30 s,共35個循環(huán)；最后延伸72℃5 min。Arp3上 游 引 物 ：5’-ATGCCCGGCTGAAATTAAGTGA-3’；下游引物：5’-TGGAAGCCAGCATTGATCCTC-3’。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）作為內參照（退火溫度54℃，其余反應條件同前）。GAPDH上游引物：5’-AGGTCCACCACTGACACGTT-3’,下游引物：5’-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3’。PCR反應結束后取10μL反應產(chǎn)物行1%瓊脂糖膠電泳觀察目的片段。相對表達量計算公式為：目的基因條帶灰度/內參條帶灰度，U251－siRNA細胞ARP3表達抑制率用以下公式計算：抑制率＝[1－(siRNA－Arp3組 Arp3相對表達量/siRNA－N組Arp3相對表達量)]×100%。

1.4 細胞總蛋白提取 分別收集轉染后48 h的siRNA－Arp3組 、siRNA－NC 組 和 siRNA－N 組 細胞，用4℃預冷的PBS洗滌細胞2次，每大皿細胞加入 400μL 裂解液（PMSF:RIPA＝1:100）,置于冰上裂解30 min;將裂解液轉移至離心管中4℃離心，12000r/min，15 min;吸取上清液并測量蛋白濃度，與含DTT的上樣緩沖液（DTT:上樣緩沖液＝1:4）等體積混合后煮沸18min；分裝儲存于－20℃。

1.5 Western blot檢測各組Arp3的表達量將不同組樣品蛋白等量上樣于12%SDS－PAGE凝膠上進行電泳，開始電壓為80V，溴酚藍進入分離膠層時調至120V,待溴酚藍接近至凝膠底部時停止電泳[電泳緩沖液為 1×Ttis－甘氨酸緩沖液（pH7.9）],300 mA恒流濕轉將蛋白由凝膠轉到PVDF膜上，膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，加入小鼠單克隆Arp3抗體（1:1000）,4℃孵育過夜，PBST洗3次，接著醋酸纖維膜在室溫下與辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠IgG二抗（1:2000）孵育1 h,PBST洗膜3次后將增強化學發(fā)光液(ECL)均勻涂于PVDF膜表面顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，最后將結果進行圖像分析，計算吸光度（A）值。采用Quantity One軟件分析條帶的灰度值，以GAPDH作為內參。

1.6 細胞免疫熒光檢測Arp2/3的細胞定位及細胞片狀偽足的變化 轉染后48 h的siRNA－Arp3組、siRNA－NC組和siRNA－N組細胞分別用預溫37℃PBS洗兩次，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗3次，5%BSA封閉30min，加入1:100稀釋的兔抗人p34抗體，4℃過夜；棄一抗，PBS沖洗3次；滴加1:100稀釋的FITC/TRITC標記的山羊抗兔熒光二抗，37℃孵育1h；棄二抗，PBS沖洗3次；滴加1:40稀釋的羅丹明鬼筆環(huán)肽室溫孵育20min；PBS沖洗 3 次；DAPI染核 5min;0.5 mol/L Na2CO3－50%甘油風封片，熒光顯微鏡下觀察并進行圖像采集。

1.7 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力每個Transwell小室上表面加入DMEM稀釋好的Matrigel(Matrigel與DMEM體積比1:2)70μL，37℃孵育30min。將細胞消化好后重懸于無血清的DMEM中，在上室中加入100μL密度為1×105個/mL的細胞懸液，下室中加入600μL含血清培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)48 h后，行結晶紫染色。用棉簽擦去濾膜上層細胞，DP70倒置相差顯微鏡（×100）觀察穿過膜的細胞數(shù)，隨機計數(shù)5個視野中細胞數(shù)目，計算每個視野內的穿過聚碳酸酯膜微孔細胞數(shù)。

1.8 劃痕實驗檢測細胞遷移能力siRNA－Arp3組、siRNA－NC組和siRNA－N組細胞分別接種于六孔板中，待其貼壁之后使用200μL槍頭盡量垂直于六孔板底部劃痕，PBS洗3次去除劃下的細胞，加入培養(yǎng)基后用倒置相差顯微鏡記錄此時及培養(yǎng)48h后細胞的遷移情況，每組重復實驗3次。

1.9 統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK檢驗。檢測水準α=0.05。

2 結果

2.1 RT-PCR、western blot驗證不同處理組中Arp3 mRNA和蛋白的表達情況半定量RT-PCR結果顯示，三組細胞的Arp3 mRNA相對表達水平分別為：19.33%±2.08%、97.33%±2.38%和96.67%±2.52%（圖1）。siRNA-Arp3組細胞與siRNA-N組U251細胞相比，抑制率達80%（P＜0.01）；而siRNA-NC組與siRNA-N組細胞的Arp3 mRNA表達水平之間的差異無統(tǒng)計學意義（P=0.73）。Western blot分析不同處理組Arp3蛋白表達情況，使用GAPDH作為內對照，結果發(fā)現(xiàn)siRNA-NC組、siRNA-N組和siRNA-Arp3組細胞Arp3蛋白相對表達量分別為85.33%±3.21%、84.33%±4.04%和20.00%±3.00%，差異有統(tǒng)計學意義（F=353.62,P＜0.01），并且siRNA-NC組與siRNA-N組之間的差異無統(tǒng)計學意義（P=0.74）。siRNA-Arp3組細胞Arp3蛋白表達抑制率為76%，和mRNA表達變化情況基本一致。

2.2 轉染Arp3-siRNA對U251細胞片狀偽足的影響 紅色熒光代表肌動蛋白，綠色熒光代表Arp2/3復合物，p34用于Arp2/3的定位（圖2）。與siRNA-NC組和siRNA-N組相比，siRNA-Arp3組細胞前端片狀偽足明顯變小甚至消失。

2.3 轉染Arp3-siRNA對細胞侵襲和遷移能力的影響 Arp3-siRNA轉染U251細胞后使其侵襲能力受到抑制（圖3，表1），侵襲至Transwell小室濾膜下表面平均每個視野穿膜細胞數(shù)在siRNA-Arp3組（42.33±3.51）、siRNA-N組（135.33±3.06）和siRNA-NC組（140.67±4.04）之間的差異有統(tǒng)計學意義（F=175.65,P＜0.01）。其中siRNA-Arp3組與siRNA-NC組（P＜0.01）和 siRNA-N 組（P＜0.01）之間的差異有統(tǒng)計學意義，而siRNA-NC組和siRNA-N組之間的差異無統(tǒng)計學意義（P=0.68）。劃痕實驗（圖3，表2）中siRNA-Arp3組面積愈合率（17.67%±3.05%）、siRNA-NC組面積愈合率（80.33%±5.51%）和siRNA-N組面積愈合率（78.33%±5.03%）之間的差異有統(tǒng)計學意義（F=724.21，P＜0.01）。其中 siRNA-Arp3組與 siRNA-NC組（P＜0.01）和siRNA-N組（P＜0.01）之間的差異有統(tǒng)計學意義，而siRNA-NC組和siRNA-N組之間的差異無統(tǒng)計學意義（P=0.12）。

表1 同一時間各組中小室濾膜下表面的細胞個數(shù)（±s）

表1 同一時間各組中小室濾膜下表面的細胞個數(shù)（±s）

1）與siRNA-Arp3組比較，單因素方差分析，P<0.05

組別siRNA－Arp3組siRNA－NC組1)siRNA－N組1)n333 48 h 42.33±3.51 135.33±3.06 140.67±4.04

表2 同一時間各組創(chuàng)面愈合率（%，±s）

表2 同一時間各組創(chuàng)面愈合率（%，±s）

1）與siRNA-Arp3組比較，單因素方差分析，P<0.05

組別siRNA－Arp3組siRNA－NC組1)siRNA－N組1)n 3 3 3 48 h 17.67±3.05 80.33±5.51 78.33±5.03

圖1 轉染48h后各組Arp3 mRNA和蛋白的表達注：1.siRNA-Arp3；2.siRNA-NC；3.siRNA-N

圖2 免疫熒光顯示各組細胞Arp2/3的定位情況及細胞形態(tài)的改變（×400）

圖3 Transwell侵襲實驗和劃痕實驗分別檢測每組細胞侵襲能力（×100）和遷移能力（×40）

3 討論

腫瘤細胞從原發(fā)部位遷移是惡性腫瘤轉移的標志，往往會導致腫瘤復發(fā)以及治療失敗，這一點在惡性膠質瘤中尤其明顯[4]。膠質母細胞瘤是最常見及惡性級別最高的原發(fā)惡性腦腫瘤，占到所有顱內腫瘤的12%～15%，星形細胞腫瘤的60%～75%。盡管適形外照射與替莫唑胺同步治療及隨后的替莫唑胺輔助化療方案應用于膠質母細胞瘤患者取得了一定效果，但膠質母細胞瘤患者的兩年病死率仍高于70%[5-9]。惡性膠質瘤廣泛浸潤到相鄰腦組織以及容易復發(fā)的趨勢使其難以根治。即使腫瘤在影像學全切除之后，80%以上的膠質母細胞瘤會在原發(fā)腫瘤邊緣2 cm以內復發(fā)[10-12]。因此，尋找更好的治療方法，如：有效控制疾病進展和復發(fā)非常緊迫，其中方法之一就是控制膠質瘤細胞的侵襲和遷移。

研究表明[13]，相對于靜止細胞來說運動中的細胞能更有效抵抗凋亡刺激。如果我們能抑制膠質瘤細胞的侵襲和遷移，把膠質瘤的侵襲性生長方式轉換成局部生長，這將大大改善膠質瘤患者的預后效果。過去幾十年，我們對細胞遷移機制的了解取得了顯著地進步?？偟膩碚f，細胞遷移包括：前端突起的形成、細胞粘附到胞外基質、胞體的移動和尾部的收縮。值得注意的是，細胞前端的突起是細胞遷移的核心結構之一[14]，進一步支持了本實驗研究結果。本課題組采用RNA干擾技術沉默Arp3的表達，通過RT-PCR、western blot驗證發(fā)現(xiàn)siRNA-Arp3組U251膠質瘤細胞中Arp3 mRNA和蛋白的表達明顯受到抑制，說明siRNA能特異性的抑制Arp3的表達。本課題組進一步采用細胞免疫熒光的方法檢測Arp2/3定位情況以及轉染Arp3-siRNA后對細胞形態(tài)的影響。研究結果顯示在siRNA-NC組和siRNA-N組U251膠質瘤細胞中其前端突起朝向劃痕區(qū)域或細胞密度較少區(qū)域并且Arp2/3定位到U251膠質瘤細胞的前端突起，而在siRNA-Arp3組U251膠質瘤細胞中前端突起變小甚至消失。上述結果說明膠質瘤細胞前端的突起可能與細胞的運動方向相關，并且Arp2/3參與膠質瘤細胞前端突起的形成。從上述發(fā)現(xiàn)中我們不難做出如下推測：首先，U251膠質瘤細胞前端突起與U251膠質瘤細胞運動密切相關；其次，沉默Arp2/3表達后U251膠質瘤細胞的運動能力可能會受到影響。

在遷移的細胞中，作為前端突起主要組成部分的片狀偽足擁有大量的分枝狀肌動蛋白絲，被認為是細胞的運動器官。在片狀偽足中，Arp2/3能夠調節(jié)已有的肌動蛋白絲從其側面形成新的肌動蛋白絲，從而在片狀偽足的形成中起到重要作用[15-17]。本研究通過transwell侵襲實驗和劃痕實驗檢測RNA干擾技術沉默Arp2/3表達后對細胞運動能力的影響。結果顯示siRNA-Arp3組U251膠質瘤細胞運動能力明顯受到抑制，提示Arp2/3復合物可能通過片狀偽足的形成來影響膠質瘤細胞的侵襲與遷移，進一步驗證了我們的推測。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的可能存在機制為：①片狀偽足作為細胞的動力器官，失去片狀偽足后細胞無法獲得運動所必需的動力；②片狀偽足在局部粘著斑形成時的空間相關性方面起到重要作用。在缺乏片狀偽足的情況下，局部粘著斑彼此之間難以對齊，從而影響細胞的遷移速度[18]。

基礎研究領域的發(fā)現(xiàn)最終還應設法應用于臨床。單憑提高手術技巧和采用目前的聯(lián)合治療方案，盡管一定程度上改善了病人的預后，但尚不能治愈惡性膠質瘤。惡性膠質瘤中的瘤細胞能分泌血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，它能促進內皮細胞增殖、遷移形成微血管，為膠質瘤細胞的侵襲、浸潤提供必備條件[19]。貝伐單抗是一種單克隆抗體，它可以與血管內皮生長因子結合阻斷其促進血管生成的作用。然而de Groot等[20]發(fā)現(xiàn)雖然貝伐單抗能夠減少瘤內血管的數(shù)量，但會導致膠質瘤細胞沿著管周和軟膜發(fā)生侵襲遷移，因此造成了貝伐單抗的應用并沒有顯著延長患者的總生存期。如果我們在采用原有聯(lián)合治療方案的基礎上，一方面抑制惡性膠質瘤微血管生成切斷腫瘤增殖所必需的養(yǎng)分供應，一方面抑制膠質瘤細胞的侵襲和遷移，這可能會對惡性膠質瘤的治療起到事半功倍的效果。從本研究中我們發(fā)現(xiàn)Arp2/3復合物在膠質瘤細胞侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用，我們相信Arp2/3復合物將成為今后有效治療膠質瘤的一個重要靶點。

[1]Vredenburgh JJ,Desjardins A,Reardon DA,et al.Experience with irinotecan for the treatment of malignant glioma[J].Neuro Oncol,2009,11(1):80－91.

[2]Liao G,Simone B,Liu G.Mis－localization of Arp2 mRNA impairs persistence of directional cell migration[J].Exp Cell Res,2011,317(6):812－822.

[3]Ginsberg MH,Schwarzbauer JE.Cell－to－cell contact and extracellular matrix[J].Curr Opin Cell Biol,2008,20(5):492－494.

[4]Palmer TD,Ashby WJ,Lewis JD,et al.Targeting tumor cell motility to prevent metastasis[J].Adv Drug Deliv Rev,2011,63(8):568－581.

[5]Kim KJ,Lee KH,Kim HS,et al.The presence of stem cell marker－expressing cells is not prognostically significant in glioblastomas[J].Neuropathology,2011,31(5):494－502.

[6]Buckner JC.Factors influencing survival in high－grade gliomas[J].Semin Oncol,2003,30(6):10－14.

[7]Peterson K.Brain tumors[J].Neurol Clin,2001,19(4):887－902.

[8]Lassman AB,Holland EC.Incorporating molecular tools into clinical trials and treatment for gliomas[J].Curr Opin Neurol,2007,20(6):708－711.

[9]Stupp R,Mason WP,van den Bent MJ,et al.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma[J].N Engl J Med,2005,352(10):987－996.

[10]Furnari FB,Fenton T,Bachoo RM,et al.Malignant astrocytic glioma:genetics,biology,and paths to treatment[J].Genes Dev,2007,21(21):2683－2710.

[11]Welsh J,Sanan A,Gabayan AJ,et al.GliaSite brachytherapy boost as part of initial treatment of glioblastoma multiforme:a retrospective multi－institutional pilot study[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2007,68(1):159－165.

[12]晏怡，鄧朝霞，唐文淵，等.Fascin－1與顱內腫瘤浸潤的初步研究[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志，2010,36(11):681－684.

[13]Insall RH,Machesky LM.Actin dynamics at the leading edge:from simple machinery to complex networks[J].Dev Cell,2009,17(3):310－322.

[14]Ridley AJ,Schwartz MA,Burridge K,et al.Cell migration:integrating signals from front to back[J].Science,2003,302(5651):1704－1709.

[15]Pollard TD.Regulation of actin filament assembly by Arp2/3 complex and formins[J].Annu Rev Biophys Biomol Struct,2007,36:451－477.

[16]Goley ED,Welch MD.The ARP2/3 complex:an actin nucleator comes of age[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2006,7(10):713－726.

[17]Mendoza MC,Er EE,Zhang W,et al.ERK－MAPK drives lamellipodia protrusion by activating the WAVE2 regulatory complex[J].Mol Cell,2011,41(6):661－671.

[18]Wu C,Asokan SB,Berginski ME,et al.Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis[J].Cell,2012,148(5):973－987.

[19]張光宇，焦保華，梁朝輝，等.基質金屬蛋白酶－9和促血管生成素1、2與垂體腺瘤侵襲性的關系[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志，2011,37(6):333－336.

[20]de Groot JF,Fuller G,Kumar AJ,et al.Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab:radiographic and pathologic correlation in humans and mice[J].Neuro Oncol,2010,12(3):233－242.