Wnt2在肝細胞肝癌中的表達及對HepG2細胞增殖的影響

吳 堃，李 輝，朱卓立，李生偉

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院肝膽外科，重慶400010)

肝細胞肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。研究肝癌發(fā)病過程中相關基因的相互作用不僅有助于更深層理解肝癌發(fā)病機制，且有助于發(fā)現(xiàn)靶向治療的新靶點。

Wnt通路是由一系列癌基因和抑癌基因編碼的蛋白質組成，其在調節(jié)胚胎發(fā)育與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等關鍵的生理、病理過程中起重要作用［1］。Wnt2是Wnt家族中的成員，近年來諸多研究已證實，Wnt2與結直腸癌、胃癌、食管鱗狀細胞癌、惡性胸膜間皮瘤、乳腺癌、膠質瘤和惡性黑色素瘤等的發(fā)生，發(fā)展有關［2－8］。

本研究探討Wnt2在原發(fā)性肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)中的表達情況。同時，采用Wnt2基因特異性siRNA轉染的方法，抑制人肝癌HepG2細胞中該基因的表達，以探討Wnt2基因對腫瘤細胞的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院肝膽外科2010年11月—2011年10月間住院手術切除肝癌和配對癌旁組織(緊鄰癌組織)56對(經(jīng)病理學證實為原發(fā)性肝細胞性肝癌)，同時收集正常肝組織20份(所獲標本均獲得重慶醫(yī)科大學倫理委員會批準書及患者知情同意書)。新鮮組織在手術離體后立即去掉壞死組織、血塊。將收集的標本分為2份，1份于30 min內以液氮冷凍，并置于－80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。?份放入10%甲醛固定。人肝癌HepG2細胞由重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院中心實驗室所保存。

1.2 主要試劑

Trizol試劑盒、反轉錄試劑盒和SYBR?Green試劑盒(TAKARA公司);免疫組化試劑盒及DAB顯色劑(重慶邁凱科技有限公司);Wnt2多克隆抗體、siRNA-Wnt2(Santa cruz公司);蛋白質提取試劑盒及蛋白濃度測定試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展公司);ECL化學發(fā)光試劑盒(Thermo公司);LipofectamineTM2000(Invetrogen公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 熒光定量PCR檢測Wnt2 mRNA表達:步驟:采用引物設計軟件(Primer 5.0)進行引物序列設計:Wnt2上游引物:5'-CGGGAATCTGCCTTTGTTT A-3'，下游引物:5'-TTCCTTTCCTTTGCATCCAC-3'，內參基因GAPDH上游引物:5'-CGACCACTTTGTCA AGCTCA-3'，下游引物:5'-AGGGGTCTACATGGCAA CTG-3'。按Trizol說明書提取RNA，按照Primescript反轉錄試劑盒合成cDNA，然后按SYBR Green反應條件進行熒光定量PCR反應，對反應的退火溫度，引物濃度進行優(yōu)化，獲得最佳反應體系和條件，用Bio-Rad RealtimePCR儀進行檢測。每個樣本每次3個復孔，重復3次，反應完成后機器自動得出各樣品的CT值，并且自動計算出基因相對表達量值。

1.3.2 免疫組織化學法檢測Wnt2蛋白的表達:步驟:常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋，制片;免疫組化法(SP法)，按試劑盒說明進行操作，PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作為陽性對照。Wnt2以胞質或胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為陽性信號。采用染色強度和染色細胞百分率綜合評估。染色強度:無染色為0分;淡棕色為1分;棕色為2分;深棕色為3分。染色細胞百分率采取每張切片在200倍顯微鏡下隨機選取5個高倍視野計數(shù):陽性細胞數(shù)＜25%為0分，25% ～50%為1分，51% ～70%為2分，＞70%為3分。評分標準將兩者積分相乘:0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為陽性(++)，7～9分為強陽性(+++)。

1.3.3 質粒轉染和細胞分組:序列設計:靶基因siRNA序列以及陰性對照序列均己在基因Gene Bank數(shù)據(jù)庫中用BLAST檢索，確認與靶細胞其他基因無同源性。Wnt2 siRNA序列為5'-GAAGATG GGAAGCGCCAAG-3'，陰性對照siRNA序列為5'-T TCTCCGAACGTGTCAGGT-3'。步驟:制備HepG2細胞懸液接種于12孔板，加入含有10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h再進行轉染，按LipofectamineTM2000說明書步驟分別進行Wnt2-siRNA和陰性對照siRNA質粒轉染。實驗分為4組:轉染W(wǎng)nt2-siRNA的實驗組，轉染陰性對照 siRNA的陰性對照組，加入 LipofectamineTM2000和培養(yǎng)液的脂質體對照組，只加入培養(yǎng)液的空白對照組。

1.3.4 RT-qPCR檢測轉染后Wnt2 mRNA表達:轉染24 h后，取1×106細胞 Trizol法提取總 RNA。反轉錄反應和PCR反應方法同前。

1.3.5 Western blot檢測轉染后Wnt2蛋白表達:轉染48 h后，提取細胞中的總蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳行蛋白分離，轉移到PVDF模上，小牛血清封閉后，加入一抗(工作濃度1∶600)，4 h，37 ℃搖床孵育過夜，洗膜3次，加入二抗(工作濃度1∶2 000)，2 h，37℃孵育過夜，洗膜3次，將 PVDF膜置于HRP-ECL化學發(fā)光試劑中反應2 min。暗室中使X線片曝光，常規(guī)方法顯影定影。

1.3.6 MTT法檢測細胞增殖:取各組對數(shù)生長期的細胞，每孔1 000個接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積200 μL，每個樣品設3個復孔，將培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO2、含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)24 h。分別于接種后24、48和72 h用MTT法檢測。檢測時，吸取各孔中培養(yǎng)液，加入新RPMI 1640 培養(yǎng)液180 μL和20 μL MTT 溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜。用酶標儀檢測570 nm波長下各孔的吸光度。

1.3.7 流式細胞儀檢測細胞周期:取各組對數(shù)生長期的細胞，0.25%胰蛋白酶消化細胞，離心，棄上清液，PBS重懸細胞，加入在－20℃預冷的75%乙醇固定，4℃固定12 h，離心，棄冰乙醇，PBS沖洗，棄上清液;加入含有PI(碘化吡啶)和RNA酶的PBS染色液，置4℃避光染色1 h。上流式細胞儀檢測細胞周期時相分布，統(tǒng)計各期細胞相對百分比。

1.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均值±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析檢驗組間差異的顯著性。計數(shù)資料以陽性率表示，采用卡方檢驗。

2 結果

2.1 肝癌、癌旁和正常肝組織中Wnt2 mRNA的檢測

各樣本的擴增曲線呈線性關系，溶解曲線呈單峰(圖1)。肝癌組，癌旁組和正常組Wnt2基因表達水平分別為 3.492±0.494、2.050±0.416和0.765±0.192(P ＜0.05)。

圖1 PCR擴增曲線和溶解曲線Fig 1 Primary curve and solubility curve

圖2 各組中Wnt2蛋白的表達Fig 2 The expression of Wnt2 protein in groups(×200)

2.2 肝癌、癌旁和正常肝組織中Wnt2蛋白的檢測

Wnt2蛋白的陽性信號主要定位于胞質和(或)胞核(圖2)。肝癌、癌旁和正常肝組織間差異有顯著性(P＜0.01)(表1)。

表1 Wnt2蛋白在各組中的表達Table 1 The expression of Wnt2 protein in groups

2.3 siRNA轉染后人肝癌HepG2細胞Wnt2 mRNA和蛋白的檢測

轉染后各組Wnt2基因及蛋白表達(表2，3，圖3)。實驗組低于各對照組(P＜0.05)。

2.4 siRNA轉染后對人肝癌HepG2細胞增殖的影響

在轉染24、48和72 h后檢測吸光度值。實驗組與對照組相比均P＜0.05(表4)。

表2 熒光定量PCR檢測Wnt2在各組中的表達Table 2 The expression of Wnt2 in groups subjected to RT-qPCR(x ± s，n=3)

表3 Western blot檢測Wnt2在各組中的表達Table 3 The expression of Wnt2 protein in groups subjected to western blot(x ± s，n=3)

圖3 Western bolt檢測各組中Wnt2蛋白表達Fig 3 The expression of Wnt2 protein in groups used Western blot

表4 Wnt2-siRNA轉染肝癌細胞對增殖活性的改變Table 4 The change of proliferation activity by Wnt2-siRNA transfection liver cancer cell(x ± s，A，n=3)

2.5 siRNA轉染后對人肝癌HepG2細胞周期的影響

轉染后實驗組與對照組相比，G1期細胞數(shù)明顯增多(P＜0.05)，S期細胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)，G2期無明顯變化(表5)。

表5 Wnt2-siRNA轉染肝癌細胞對細胞周期的影響Table 5 The influence of cell cycle by Wnt2-siRNA transfection liver cancer cell(±s，%，n=3)

表5 Wnt2-siRNA轉染肝癌細胞對細胞周期的影響Table 5 The influence of cell cycle by Wnt2-siRNA transfection liver cancer cell(±s，%，n=3)

＊P ＜ 0.05 compared with control．

group cell cycle G0/G1 S G2/GM blank 38.6±3.7 43.2±2.5 18.2±2.0 negative control 40.4±1.2 41.2±2.7 18.0±1.5 liposome control 41.8±4.3 41.5±4.7 16.7±2.0 experimental 64.9±1.9* 19.9±1.3* 15.2±2.0*

3 討論

Wnt基因的發(fā)現(xiàn)已有 30年，早在 1982年Nusse［9］等人將鼠乳腺腫瘤病毒整合到小鼠宿主染色體上，激活了該位點的基因并在小鼠中引起了腫瘤的發(fā)生，他們將該位點的基因命名為int1，且認為它是一種致癌基因。但后來的研究發(fā)現(xiàn)int1基因不僅出現(xiàn)在腫瘤中，在小鼠的胚胎發(fā)育中也起重要作用，與果蠅的胚胎發(fā)育基因wingless(wg)屬同源基因，wg基因突變導致果蠅無翅。因此將二者名字結合提出了Wnt基因的稱謂。Wnt基因在細胞正常的生長、發(fā)育、分化、凋亡中起作用，但是它也參與細胞的惡性轉化，以及腫瘤細胞的侵襲和轉移等一系列生理病理過程［10］。

目前，關于Wnt通路與腫瘤關系的研究多數(shù)集中于Wnt信號系統(tǒng)成員 E-cadherin、β-catenin、APC和Axin等，Wnt基因本身表達異常與腫瘤之間關系的研究較多的也僅是Wnt1和Wnt5，Wnt2研究的報道較少。為此，本實驗一開始在人肝癌中測出了Wnt2基因的高表達，再進一步以Wnt2特異性siRNA轉染人肝癌HepG2細胞來觀察肝癌細胞的增殖生長情況。

本研究發(fā)現(xiàn)肝癌和癌旁中Wnt2 mRNA或蛋白都高于正常肝組織，且Wnt2特異性siRNA轉染人肝癌細胞系HepG2后。實驗組Wnt2基因表達低于各對照組，說明Wnt2 siRNA轉染后能有效抑制細胞相應靶基因的表達。Western blot檢測各組Wnt2蛋白表達的變化，發(fā)現(xiàn)其與Wnt2 mRNA的變化一致。實驗結果證實了siRNA轉染后不但能抑制靶基因的轉錄，也能抑制其蛋白的翻譯和表達。MTT法檢測顯示實驗組細胞增殖速度較對照組明顯降低，提示用siRNA使Wnt2基因沉默后，能抑制肝癌細胞的增殖;而對照組之間無明顯差別，從而排除了載體刺激因素導致細胞增殖力的改變。經(jīng)流式細胞儀檢測細胞周期的結果提示使用siRNA敲低肝癌細胞中Wnt2的表達后，G1期細胞數(shù)明顯增多，S期細胞數(shù)明顯減少，能夠有效抑制肝癌細胞的生長，并引起肝癌細胞生長周期的停滯。

綜上所述，Wnt2在肝癌中高表達，可以作為HCC診斷的一個重要新指標。轉染靶向Wnt2的siRNA可有效敲低該基因在人肝癌細胞系HepG2內的表達，且抑制了細胞的增殖能力。因此，對其進一步研究可望提出肝癌治療的新策略。

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