DJ－1拮抗ROS介導(dǎo)Beclin－1上調(diào)在缺氧復(fù)氧HL－1心肌細(xì)胞中的作用

晏 浩，李文林，徐建軍，朱書(shū)強(qiáng)，龍 翔，車(chē)建鵬

(南昌大學(xué)1.第二附屬醫(yī)院胸心外科;2.醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，江西南昌330006)

癌基因DJ-1(CAP1/RS/PARK7)在腫瘤生物學(xué)中發(fā)揮極為重要的作用，它可保護(hù)腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和適應(yīng)氧化應(yīng)激［1］。DJ-1在人體各正常組織又廣泛表達(dá)，其通過(guò)在亞細(xì)胞水平的再分布發(fā)揮多重作用。常染色體隱性遺傳DJ-1突變可以導(dǎo)致早發(fā)型帕金森病，缺乏DJ-1類(lèi)型的帕金森病患者對(duì)中風(fēng)損傷更易感，而恢復(fù)DJ-1表達(dá)可以明顯減少氧化應(yīng)激［2］。心肌缺血再灌注后往往同時(shí)出現(xiàn)壞死、凋亡和自噬［3］;其中，自噬是細(xì)胞長(zhǎng)存蛋白和細(xì)胞器代謝的主要方式。缺血再灌注損傷不同階段自噬發(fā)揮不同作用，缺血階段AMPKa啟動(dòng)低程度自噬被認(rèn)為是應(yīng)急供能的保護(hù)作用，而再灌注階段通過(guò)激活JNK導(dǎo)致過(guò)表達(dá)Beclin-1，過(guò)度自噬加重心肌損傷［4］。最近研究認(rèn)為DJ-1參與自噬調(diào)控［5］，本研究通過(guò)以慢病毒為載體干擾心肌HL-1細(xì)胞DJ-1基因表達(dá)，探討其對(duì)缺氧復(fù)氧損傷中ROS影響對(duì)心肌自噬及預(yù)后的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

annexinⅤ-PI凋亡檢測(cè)試劑盒和活性氧檢測(cè)試劑盒 (南京凱基公司);monodansylcadaverin(MDC)和N-acetylcysteine(NAC)(Sigma-Aldrich美國(guó));DJ-1shRNA慢病毒(sc-37081)、空對(duì)照慢病毒(sc-108080)和抗體 β-actin(Santa Cruz公司);抗體 Beclin-1(Cell Signaling公司)和 DJ-1、LC3(Abcam公司)及辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)抗體(北京中杉公司);增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒(Thermo公司);蛋白提取試劑盒、蛋白酶磷酸酶復(fù)合抑制劑(普利萊公司);BCA蛋白定量(碧云天公司);其他試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系培養(yǎng)和sh-DJ-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選:小鼠心肌HL-1細(xì)胞系來(lái)源于William Claycomb實(shí)驗(yàn)室，采用DJ-1shRNA慢病毒和空對(duì)照慢病毒感染HL-1細(xì)胞，慢病毒以感染復(fù)數(shù)值為30孵育HL-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染，感染后96 h傳代培養(yǎng);感染細(xì)胞再培養(yǎng)48 h后嘌呤霉素10 mg/L篩選，再常規(guī)培養(yǎng)待實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 缺氧復(fù)氧損傷模型的建立:穩(wěn)定表達(dá)篩選后HL-1細(xì)胞進(jìn)行缺氧復(fù)氧培養(yǎng)，37℃預(yù)熱配置的缺氧液和復(fù)氧液，將培養(yǎng)的HL-1細(xì)胞換用的預(yù)充有95%N2+5%CO2的缺氧液，95%N2+5%CO2的密閉容器中培養(yǎng)2 h。再將缺氧的心肌細(xì)胞換用預(yù)充95%O2+5%CO2的含糖復(fù)氧液，并在95%O2+5%CO2的密閉容器中培養(yǎng)4 h，建立缺氧/復(fù)氧損傷模型。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組:根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)分為5組:1)正常對(duì)照組(control):更換正常培養(yǎng)基后在CO2培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)6 h;2)單純?nèi)毖鯊?fù)氧組(H/R):更換缺氧液缺氧培養(yǎng)2 h，再更換復(fù)氧液復(fù)氧培養(yǎng)4 h;3)空慢病毒缺氧復(fù)氧組(H/R control virus):空慢病毒感染細(xì)胞更換缺氧液缺氧培養(yǎng)2 h，再更換復(fù)氧液復(fù)氧培養(yǎng)4 h;4)慢病毒shDJ-1缺氧復(fù)氧組(H/R shDJ-1 virus):慢病毒shDJ-1感染細(xì)胞更換缺氧液缺氧培養(yǎng)2 h，再更換復(fù)氧液復(fù)氧培養(yǎng)4 h;5)慢病毒shDJ-1缺氧復(fù)氧 +NAC(H/R shDJ-1 virus plus NAC)組:慢病毒shDJ-1感染細(xì)胞更換缺氧液(含5 mmol/L NAC)缺氧培養(yǎng)2 h，再更換復(fù)氧液(含5 mmol/L NAC)復(fù)氧培養(yǎng)4 h。

1.2.4 細(xì)胞蛋白制備和Western blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)水平:按照細(xì)胞總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取蛋白，并按BCA法蛋白定量檢查蛋白濃度，采用聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜2 h，Beclin-1和DJ-1以 β-actin為內(nèi)參蛋白，LC3蛋白轉(zhuǎn)化以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值參考，膠片曝光，通過(guò)ImageJ圖像軟件分析統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HL-1細(xì)胞內(nèi)ROS、自噬溶酶體和死亡情況:細(xì)胞死亡檢測(cè)參照AnnexinⅤ-PI細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)，通過(guò)流式細(xì)胞儀(BD)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，AnnexinⅤ熒光信號(hào)呈綠色，表示早期凋亡細(xì)胞，PI熒光信號(hào)呈紅色，表示晚期凋亡細(xì)胞和其他膜完整破壞的死亡細(xì)胞;MDC染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的自噬體，收集各組HL-1細(xì)胞洗滌后加入50 μmol/L MDC避光孵育10 min，洗滌后通過(guò)流式細(xì)胞儀激發(fā)波長(zhǎng)340 nm，而DCFH-DA染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的自噬體，收集各組HL-1細(xì)胞洗滌后加入10 μmol/L DCFH-DA 避光孵育20 min，洗滌后通過(guò)流式細(xì)胞儀(BD)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm。所有數(shù)據(jù)通過(guò)CellQuest軟件分析統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～5次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)(±s)表示，使用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間有顯著差異者用Tukey's-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 DJ-1shRNA慢病毒對(duì)HL-1細(xì)胞DJ-1蛋白的沉默效率

相比正常對(duì)照和空慢病毒感染細(xì)胞，慢病毒shDJ-1感染細(xì)胞均顯著下調(diào)DJ-1蛋白(圖1)。

2.1 各組HL-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化

相比正常組，單純?nèi)毖鯊?fù)氧組顯著上調(diào)HL-1細(xì)胞內(nèi)ROS，而H/R shDJ-1 virus組加劇缺氧復(fù)氧導(dǎo)致ROS水平上調(diào)。使用自由基清除劑NAC可以有效減少HL-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平(圖2)。

圖1 慢病毒感染HL-1細(xì)胞DJ-1蛋白表達(dá)變化Fig 1 Expression change of DJ-1 after lentivirus transfection

2.3 各組HL-1細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量和Beclin-1、LC3蛋白轉(zhuǎn)化的變化

相比空病毒感染缺氧復(fù)氧組，慢病毒shDJ-1缺氧復(fù)氧組和慢病毒shDJ-1缺氧復(fù)氧+NAC組均減少DJ-1表達(dá)(圖4);空病毒感染缺氧復(fù)氧組相比正常對(duì)照組增加LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ;而相比單純?nèi)毖鯊?fù)氧組和空病毒感染缺氧復(fù)氧組，H/R shDJ-1 virus組顯著增加LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ，而NAC可以有效減少LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ(圖5)。對(duì)于自噬主要蛋白Beclin-1，相比空病毒感染缺氧復(fù)氧組，H/R shDJ-1 virus組顯著上調(diào)Beclin-1，而NAC可以有效減少Beclin-1上調(diào)(圖4)。

相比正常對(duì)照組，單純?nèi)毖鯊?fù)氧組顯著增加自噬體數(shù)量，而且H/R shDJ-1 virus組自噬體數(shù)量顯著多于空病毒感染缺氧復(fù)氧組和單純?nèi)毖鯊?fù)氧組，但添加NAC并未顯著減少自噬體數(shù)量(圖3)。

2.4 各組HL-1細(xì)胞死亡情況

由于缺氧復(fù)氧時(shí)間較短，各組間PI染色的細(xì)胞死亡無(wú)明顯差異;而在AnnexinⅤ染色中，而相比單純?nèi)毖鯊?fù)氧組和空病毒感染缺氧復(fù)氧組，H/R shDJ-1 virus組顯著增加早期凋亡;而添加NAC可以顯著減少DJ-1敲除導(dǎo)致的早期凋亡(圖6)。

圖2 慢病毒感染HL-1細(xì)胞缺氧復(fù)氧后ROS水平變化Fig 2 Change of ROS level after lentivirus transfection and hypoxia/reoxygenation

3 討論

DJ-1是位于人染色體1p36.23位點(diǎn)的高度保守蛋白，一般認(rèn)為DJ-1在細(xì)胞缺氧、氧化應(yīng)激和分子伴侶等方面發(fā)揮重要作用。該研究采用心肌HL-1細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，觀察到敲除DJ-1后可增加HL-1細(xì)胞內(nèi)自噬體、上調(diào)Beclin-1和增加LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ的自噬標(biāo)志過(guò)程，同時(shí)增加缺氧復(fù)氧HL-1細(xì)胞的死亡，而氧自由基清除劑NAC可以消除這些作用。

圖5 慢病毒感染HL-1細(xì)胞缺氧復(fù)氧后LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化LC3-Ⅱ程度變化Fig 5 Conversion of LC3-Ⅰ to LC3-Ⅱ after lentivirus transfection and hypoxia/reoxygenation

DJ-1被認(rèn)為具有抗氧自由基的作用，在生理?xiàng)l件下DJ-1維持線粒體生理活性和減少氧自由基生成［6］，在短期氧化應(yīng)激就促進(jìn)大量DJ-1被轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，并在外膜形成二聚體直接抵抗氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷［7］。長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)激時(shí)DJ-1進(jìn)一步聚集到細(xì)胞核，DJ-1通過(guò)穩(wěn)定抗氧化核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)Nrf2調(diào)控的谷胱苷肽、谷氨酰半胱氨酸合成酶等抗氧化物質(zhì)轉(zhuǎn)錄，減少氧化應(yīng)激損傷［8－9］。

圖6 慢病毒感染HL-1細(xì)胞缺氧復(fù)氧后細(xì)胞死亡情況Fig 6 Cell death after lentivirus transfection and hypoxia/reoxygenation

自噬是哺乳動(dòng)物細(xì)胞大分子物質(zhì)和細(xì)胞器的循環(huán)代謝的主要降解途徑，氧化應(yīng)激也被認(rèn)為也是誘導(dǎo)自噬的主要因素［10］，該研究發(fā)現(xiàn)DJ-1敲除明顯上調(diào)ROS，而ROS水平增加可以明顯上調(diào)Beclin-1表達(dá)，這與腫瘤細(xì)胞中通過(guò)JNK信號(hào)途徑介導(dǎo)自噬相一致［11］。應(yīng)激條件下，自噬的作用一直有爭(zhēng)議，在心肌缺血再灌注損傷中，缺血期輕度自噬被認(rèn)為有保護(hù)作用［12］，而在灌注期激活過(guò)度Beclin-1介導(dǎo)自噬被認(rèn)為會(huì)加重心肌損傷;而且凋亡和自噬之間關(guān)系密切，凋亡啟動(dòng)過(guò)程中激活的caspase可以剪切Beclin-1，剪切后形成的C端Beclin-1可以結(jié)合線粒體，并促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素C釋放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13］。所以，推測(cè)在缺氧復(fù)氧模型中敲除DJ-1增加凋亡的機(jī)制可能也包括Beclin-1介導(dǎo)有害自噬而促進(jìn)凋亡。

由于在神經(jīng)元DJ-1、PINK1和Parkin對(duì)于大分子物質(zhì)形成復(fù)合體介導(dǎo)異常折疊蛋白的降解過(guò)程;對(duì)于細(xì)胞器，例如線粒體，DJ-1也參與PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬［14］。而在心肌HL-1細(xì)胞敲除DJ-1并未明顯影響自噬降解過(guò)程，有文獻(xiàn)報(bào)道DJ-1與PINK1及Parkin的作用是平行互補(bǔ)的，所以可能DJ-1自噬介導(dǎo)作用可能被PINK1及Parkin所替代［15］。

DJ-1參與心肌缺血保護(hù)的機(jī)制頗為復(fù)雜，迄今尚未完全清楚，但抗氧化應(yīng)激被認(rèn)為是其主要機(jī)制，對(duì)DJ-1深入研究將為缺血心肌病的診療提供新的靶點(diǎn)。

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