風(fēng)藥、補(bǔ)虛藥對腦缺血大鼠淀粉樣β蛋白及其蛋白前體表達(dá)的影響

王海征 張秋霞 趙 暉 張 弛 張 楠 王雅麗 楊亦龍

(1首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京，100069;2北京中醫(yī)藥大學(xué)期刊中心，北京，100029)

醫(yī)圣張仲景在《內(nèi)經(jīng)》的基礎(chǔ)上，提出了中風(fēng)的病名，認(rèn)為中風(fēng)的病機(jī)是“內(nèi)虛邪中”。侯氏黑散是張仲景針對中風(fēng)“正虛邪中”病機(jī)關(guān)鍵而創(chuàng)立的治療中風(fēng)“第一方”［1］。方中以風(fēng)藥(菊花、防風(fēng)、桂枝、川芎、細(xì)辛、桔梗)祛風(fēng)、搜風(fēng)、熄風(fēng)，配伍補(bǔ)虛藥(白術(shù)、人參、茯苓、當(dāng)歸)益氣健脾、補(bǔ)益肝血，充分體現(xiàn)了風(fēng)藥佐助補(bǔ)虛藥治療腦中風(fēng)的用藥特色?！督?jīng)方發(fā)揮》認(rèn)為“《金匱要略》之侯氏黑散……列為治中風(fēng)之首方，絕非偶然，而是有其深刻意義。”前期研究表明［1－6］，侯氏黑散可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子、控制星形膠質(zhì)細(xì)胞的適度活化，減少炎性反應(yīng)因子的釋放，對腦缺血大鼠神經(jīng)血管單元有很好的保護(hù)作用。為進(jìn)一步闡釋侯氏黑散組方之精妙，本文利用免疫組化方法觀察淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)、β－淀粉樣蛋白(β－amyloid protein，Aβ)在缺血大鼠腦組織的表達(dá)變化，探討侯氏黑散方中風(fēng)藥、補(bǔ)虛藥及風(fēng)藥補(bǔ)虛藥聯(lián)用對腦缺血大鼠軸突轉(zhuǎn)運(yùn)及淀粉樣沉淀的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性Sprague－Dawley大鼠，清潔級，體重280～300 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供(許可證號為SCXK(京)2012－0001)。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(許可證號為SYXK(JING)2010－0020)。將動物分為假手術(shù)組、模型組、風(fēng)藥組、補(bǔ)虛藥組、風(fēng)藥補(bǔ)虛藥聯(lián)用組(簡稱聯(lián)用藥組)。

1.2 受試藥物 侯氏黑散方中主要藥物分為風(fēng)藥組、補(bǔ)虛藥組。風(fēng)藥由菊花40 g、防風(fēng)10 g、桂枝3 g、川芎3 g、細(xì)辛3 g、桔梗8 g組成;補(bǔ)虛藥由人參3 g、白術(shù)10 g、茯苓3 g、干姜3 g、當(dāng)歸3 g組成。(藥物劑量依據(jù)《金匱要略》侯氏黑散原方的劑量比例確定)。風(fēng)藥補(bǔ)虛藥聯(lián)用組由菊花40 g、防風(fēng)10 g、桂枝3 g、川芎3 g、細(xì)辛3 g、桔梗8 g、生白術(shù)10 g、茯苓3 g、干姜3 g、當(dāng)歸3 g、人參3 g組成。中藥購自北京同仁堂藥店。

1.3 試劑 APP:#1565－1，EPITOMICS;Aβ42:ab10148，Abcam;山羊抗兔IgG －HRP:ANR02－1，欣博盛生物;蘇木素:CW0127，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;DAB，ZLI－9018，中杉金橋;3%H2O2，中杉金橋;兔超敏二步法檢測試劑盒:PV－9001，中杉金橋。

1.4 主要儀器 DENVER INSTRUMENT電子天平:北京賽多利萁儀器系統(tǒng)有限公司;微波爐(PTOD20TL－D4):格蘭仕微波爐電器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱:天津市泰斯特儀器有限公司;MENLAB－U/4C501H生物信號采集處理系統(tǒng):南京美易科技有限公司;光學(xué)顯微鏡Nikon Eclipse 80i:日本;渦旋振蕩器(VG3S25):IKA公司;臺式離心機(jī)(94－108):Sigma公司;AR1140電子天平:美國Adrenturer公司;NIS－Elements Basic Research圖像采集分析系統(tǒng)，日本;centrifuge 5810R離心機(jī):美國Eppendorf公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 腦缺血大鼠模型制備 參照文獻(xiàn)［7］制備大腦中動脈永久性缺血模型。雄性Sprague－Dawley大鼠，麻醉后，仰臥固定，結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈。將預(yù)先處理成圓頭的尼龍線(直徑0.265 mm)置于頸內(nèi)動脈18 mm，阻斷大腦中動脈的血液供應(yīng)，扎緊動脈殘端，縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠麻醉后，僅暴露頸內(nèi)外動脈分支，不閉塞大腦中動脈。參考Zea Longa［8］法于缺血24 h、48 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。通過神經(jīng)功能評分判斷腦缺血模型的成功與否，2～3分為入選動物。

2.2 分組及給藥 60只SD雄性大鼠，用隨機(jī)數(shù)字表方法將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組、模型組、風(fēng)藥組、補(bǔ)虛藥組，聯(lián)用藥組，每組12只動物。給藥劑量按體表面積折算，風(fēng)藥組等效劑量為7.7 g/kg;補(bǔ)虛藥組等效劑量為2.59 g/kg;聯(lián)用藥組等效劑量為10.5 g/kg。各給藥組先灌胃給藥3 d，第4 d給藥后20 min施行手術(shù)，術(shù)后24 h及48 h各組每6 h給藥1次。模型組灌胃等容量生理鹽水。

2.3 取材及標(biāo)本處理 大鼠造模后分別于缺血24 h、48 h取材。每組隨機(jī)取5只大鼠，麻醉后，生理鹽水快速灌流至清澈。繼以4%多聚甲醛0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)心內(nèi)灌注固定，待充分固定后，開顱取腦。冠狀位取視交叉向尾端3～4 mm組織塊，投入相同固定液于4℃固定1周后，常規(guī)石蠟包埋，切片，進(jìn)行免疫組化染色。

2.4 APP、Aβ42檢測 采用二步法免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行染色。APP、Aβ42免疫組織化學(xué)染色暴露抗原方法:用0.01 mol/L的檸檬酸緩沖液進(jìn)行微波修復(fù)，PBS沖洗。然后每片滴加一抗50 μL(APP抗體稀釋濃度1∶100;Aβ42抗體稀釋濃度1∶50)，4℃孵育40 h，37℃孵育1 h，PBS沖洗。接著每片滴加二抗Ⅰ50 μL，37℃孵育0.5 h，PBS沖洗，每片滴加二抗Ⅱ50 μL，37℃孵育1 h，PBS沖洗。最后DAB顯色25 min，蒸餾水洗滌終止，蘇木素染細(xì)胞核5 min，顯色后脫水、透明、封片。

表1 風(fēng)藥、補(bǔ)虛藥對腦缺血大鼠皮層APP表達(dá)的影響(IOD:s，n=5)

表1 風(fēng)藥、補(bǔ)虛藥對腦缺血大鼠皮層APP表達(dá)的影響(IOD:s，n=5)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

假手術(shù)組 7633.21±4908.46＊＊ 8962.43±6059.67＊＊模型組 16067.40±11588.74 25097.16±13264.01風(fēng)藥組 12843.80±5874.36 16542.14±5403.21*補(bǔ)虛藥組 10634.40±3613.26* 20982.00±6772.84聯(lián)用藥組 6528.33±2705.76＊＊24905.17±15243.36

表2 風(fēng)藥、補(bǔ)虛藥對腦缺血大鼠皮層Aβ42表達(dá)的影響(IOD:s，n=5)

表2 風(fēng)藥、補(bǔ)虛藥對腦缺血大鼠皮層Aβ42表達(dá)的影響(IOD:s，n=5)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

24 h 48 h假手術(shù)組 855.00±761.71＊＊ 794.50±511.03組別＊＊模型組 13547.69±7183.60 17395.77±9104.63風(fēng)藥組 12829.25±5865.49 12245.82±5873.84補(bǔ)虛藥組 11248.00±7170.08 17295.00±12773.28聯(lián)用藥組 12743.56±9080.78 9743.00±4618.24＊＊

2.5 圖像分析 在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組化染色切片，在各組動物右側(cè)(缺血側(cè))顳葉皮層選取5個(gè)視野，LEICA數(shù)字顯微照相機(jī)采集圖像，利用NIS－Elements Basic Research圖像采集分析系統(tǒng)分析每個(gè)視野下APP及 Aβ42陽性表達(dá)的積分光密度(IOD，integrated optical density)以反映APP及Aβ42免疫染色強(qiáng)度。

3 結(jié)果

APP表達(dá)主要位于神經(jīng)元核周體及周圍的軸突部位。缺血24 h后，缺血側(cè)腦組織APP免疫反應(yīng)明顯增強(qiáng)，棕黃色顆粒增多，染色加深，免疫陽性細(xì)胞呈叢狀聚集。圖像分析結(jié)果顯示，缺血24 h、48 h大鼠顳葉皮層APP表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01);與模型組相比，補(bǔ)虛藥、聯(lián)用藥可明顯下調(diào)缺血24 h大鼠顳葉皮層APP的表達(dá)(P＜0.01或P＜0.05);缺血48 h，風(fēng)藥組大鼠顳葉皮層APP表達(dá)也明顯低于模型組(P＜0.05)。見表1，圖1。

Aβ42陽性表達(dá)物為棕褐色顆粒，分布于神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中，并可見細(xì)胞核皺縮。隨著缺血時(shí)間延長，Aβ42陽性表達(dá)增強(qiáng)。圖像分析結(jié)果顯示，缺血24 h、48 h大鼠顳葉皮層Aβ42表達(dá)較假手術(shù)組增強(qiáng)(P＜0.01);風(fēng)藥補(bǔ)虛藥聯(lián)用可明顯下調(diào)缺血48 h大鼠顳葉皮層Aβ42表達(dá)，差異較模型組顯著(P＜0.01)。見表 2，圖 2。

圖1 腦缺血后大鼠皮層APP表達(dá)的變化(bar=50 μm)

圖2 腦缺血后大鼠皮層Aβ42表達(dá)的變化(bar=50 μm)

4 討論

淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)為具有受體樣結(jié)構(gòu)的跨膜糖蛋白［9］，通過軸漿快速順行運(yùn)輸，具有維護(hù)突觸膜穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和分化，抑制絲氨酸蛋白酶活性等作用［10］。近期研究表明，淀粉樣前體蛋白也參與腦缺血損傷過程［11－13］，并且是腦缺血的敏感指標(biāo)之一［14］。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血24 h后，缺血側(cè)腦組織APP生成增多，APP代謝產(chǎn)物Aβ42表達(dá)明顯增高，隨著缺血時(shí)間延長，APP、Aβ42表達(dá)均成上升趨勢。軸突纖維易受到缺氧或缺血性損傷［15］，相關(guān)研究表明，局灶性腦缺血2 h后，就可見細(xì)胞骨架破壞，有髓纖維快速軸突運(yùn)輸發(fā)生障礙［16］。APP作為軸突損傷后的一種快速反應(yīng)性蛋白在軸突微管結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞骨架崩潰后，出現(xiàn)異常聚集［17］，APP的代謝方式有淀粉樣降解途徑(amyloidogenic pathway)和非淀粉樣降解途徑(nonamyloidogenic pathway)。生理狀態(tài)下，APP主要經(jīng)非淀粉樣降解途徑代謝，而病理狀態(tài)下，APP則以淀粉樣降解途徑代謝，產(chǎn)生過量的Aβ42與Aβ40，造成Aβ的積聚［18］。目前研究表明APP的過度表達(dá)可直接引起神經(jīng)損害，促神經(jīng)細(xì)胞凋亡［19］。但APP的神經(jīng)毒性主要是由APP異常裂解產(chǎn)生的Aβ所引起。Aβ42與Aβ40相比，延長的兩個(gè)氨基不僅增加了Aβ的疏水性，而且使其更容易聚集，具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性［20］，可觸及多種毒性機(jī)制:如通過突觸體脂質(zhì)過氧化物作用，引起自由基生成和氧化應(yīng)激，損傷神經(jīng)元;并通過擾亂細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［21－22］;還可直接激活補(bǔ)體系統(tǒng)，通過補(bǔ)體經(jīng)典途徑和膜攻擊復(fù)合物介導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)毒性［23－24］。因而調(diào)節(jié) APP表達(dá)，抑制 Aβ42異常聚集，可減輕神經(jīng)元損傷并減緩神經(jīng)元退行性變進(jìn)程。

現(xiàn)代《中藥學(xué)》以功效分類，將大部分風(fēng)藥歸入解表藥中，突出了它們發(fā)散表邪、解除表證的作用，卻淡化了其他一些重要功能，在一定程度上束縛了風(fēng)藥的應(yīng)用范圍。侯氏黑散是仲景治療缺血性腦中風(fēng)的主方，方中集合諸藥祛風(fēng)、搜風(fēng)、熄風(fēng):菊花用至四十分，祛風(fēng)平肝;防風(fēng)用至十分，助菊花祛風(fēng);川芎亦治風(fēng)，本經(jīng)謂治“中風(fēng)入腦頭痛”;細(xì)辛善治暗風(fēng)卒倒(《世醫(yī)得效方》);桂枝祛風(fēng)更為仲景所推崇。配以白術(shù)、人參、茯苓益氣健脾，當(dāng)歸補(bǔ)肝血、潤肝燥。全方體現(xiàn)了風(fēng)藥佐助補(bǔ)虛藥“補(bǔ)不足，損有余”的立法思想。本研究利用經(jīng)典的腦缺血大鼠模型，探討侯氏黑散方中風(fēng)藥、補(bǔ)虛藥對淀粉樣β蛋白及其蛋白前體表達(dá)的單獨(dú)效應(yīng)及聯(lián)合作用。結(jié)果表明，風(fēng)藥、補(bǔ)虛藥單獨(dú)應(yīng)用雖可不同程度降低APP表達(dá)，但對Aβ42的異常積聚沒有明顯的阻抑作用，補(bǔ)虛藥與風(fēng)藥聯(lián)用可明顯下調(diào)APP表達(dá)，抑制Aβ4的異常積聚，降低Aβ42的毒性，從而發(fā)揮神經(jīng)元的保護(hù)作用。仲景作為中醫(yī)學(xué)理、法、方、藥的奠基人，治療腦中風(fēng)善用“風(fēng)藥”，所立經(jīng)方中“風(fēng)藥”妙用者舉不勝舉。長期的醫(yī)療實(shí)踐證明，風(fēng)藥非獨(dú)祛風(fēng)，在調(diào)節(jié)人體臟腑經(jīng)絡(luò)、暢達(dá)氣血津液等方面有著重要的意義，應(yīng)用范圍相當(dāng)廣泛，尤其在多種配伍中具有獨(dú)特增效作用［25－26］。因此深入探討風(fēng)藥佐助補(bǔ)虛藥抗腦血損傷的作用機(jī)制，不僅有助于闡釋仲景“內(nèi)虛邪中”腦中風(fēng)病機(jī)理論，還可指導(dǎo)風(fēng)藥在腦卒中臨床治療的合理配伍應(yīng)用，拓寬中醫(yī)治療腦中風(fēng)的思路。

［1］張秋霞，趙暉.侯氏黑散對大鼠大腦中動脈閉塞模型缺血腦組織Na+－K+－ATP酶及一氧化氮合酶活性的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14(7):31 －33.

［2］趙暉，張秋霞，穆陽.侯氏黑散對缺血性中風(fēng)大鼠NGF表達(dá)的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006，12(11):43 －46.

［3］趙暉，張秋霞，穆陽.侯氏黑散對腦缺血大鼠血液流變學(xué)及自由基代謝的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006，12(12):38 －40.

［4］張秋霞，趙暉.侯氏黑散對MCAO大鼠大腦皮質(zhì)TGF－β1、bFGF蛋白表達(dá)的影響［J］.遼寧中醫(yī)，2007，34(2):238 －240.

［5］穆陽，趙暉，張秋霞.侯氏黑散及拆方對MCAO大鼠神經(jīng)病理學(xué)的影響［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，33(1):60 －62，65.

［6］Qiuxia Zhang，Hui Zhao，Lei Wang，et al.Effects of wind － dispelling drugs and deficiency－nourishing drugs of houshiheisan compound prescription on astrocyte activation and inflammatory factor expression in the corpus striatum of cerebral ischemia rats［J］.Neural Regeneration Research，2012，7(24):1851 －1857.

［7］田金洲.血管性癡呆［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003:598－607.

［8］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84 －91.

［9］邢兆宏，張秋霞，趙輝，等.補(bǔ)陽還五湯與六味地黃丸合方對腦缺血大鼠APP蛋白及突觸重構(gòu)的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(20):161－165.

［10］王嘉鵬，崔理立，張應(yīng)玖.淀粉樣前體蛋白(APP)相互作用及其生物學(xué)意義［J］.生命科學(xué)，2009，21(2):253 －258.

［11］歐陽欣，于挺敏.瑞香對大鼠前腦缺血后β－APP表達(dá)的影響［J］.中華腦血管病雜志，2012，6(6):309 －312.

［12］Koike MA，Lin AJ，Pham J，Nguyen E，et al.APP konckout mice experence acute mortality as the result of ischemia［J］.PLos One，2012，7(8):1－8.

［13］Koike MA，Garcia FG，，Kitarawa M，Green KN，et al.Long term changes in phospho－APP and tau aggregation in the 3xTg－AD mice following cerebral ischemia［J］.Neurosci Lett，2011，495(1):55 －59.

［14］徐振華，許能貴，符文彬，等.電針對局灶性腦缺血大鼠缺血區(qū)APP與Tau－1蛋白表達(dá)的影響［J］.中國老年學(xué)雜志，2010，30(3):361－363.

［15］王麗娟，趙玉梅，石學(xué)明.短暫性局灶性腦缺血軸突損傷定量研究方法［J］.腦與神經(jīng)疾病雜志，2010，18(3):216 －220.

［16］Dewar D，Yam P，McCulloch J.Drug development for stroke:importance of protecting cerebral white matter［J］.Eur J Pharmacol，1999，375(1－3):41－50.

［17］Koo EH，Sisodia SS，Archer DR，et al.Precursor of amyloid protein in Alzheimer disease undergoes fast anterograde axonal transport［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1990，87(4):1561 －1565.

［18］Zhang YW，Thompson R，Zhang H，et al.APP processing in Alzheimer's disease［J］.Mol Brain，2011，4:3.

［19］Kienlen －Campard P，Tasiaux B，Octave JN.The processing and biological function of the human amyloid precursor protein(APP):lessons from different cellular models［J］.Exp Gerontol，2000，35(6 － 7):843－850.

［20］官杰，劉劍剛，李浩，等.還腦益聰方提取物對阿爾茨海默病模型小鼠腦組織Aβ、APP及相關(guān)分泌酶表達(dá)的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22(3):236 －240.

［21］白洪濤，尹勇，趙萬，等.彌漫性軸索損傷后早期β淀粉樣前體蛋白及其炎性因子變化規(guī)律研究［J］.海南醫(yī)學(xué)，2012，23(9):92 －94.

［22］Van Nostrand WE，Davis J，Previti ML，et al.Clearance of amyloid －βprotein deposits in transgenic mice following focal cerebral ischemia［J］.Neurodegener Dis，2013，10(1 －4):108 －111.

［23］Heurtaux T，Michelucci A，Losciuto S，et al.Microglial activation depends on beta－amyloid conformation:role of the formylpeptide receptor 2［J］.J Neurochem，2010，114(2):576 －586.

［24］Marchesi VT.Alzheimer's dementia begins as a disease of small blood vessels，damaged by oxidative－induced inflammation and dysregulated amyloid metabolism:implications for early detection and therapy［J］.FASEB J，2011，25(1):5 －13.

［25］王麗萍，白雪，楊思進(jìn).祛風(fēng)藥治療缺血性中風(fēng)的研究進(jìn)展［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2006，4(2):146－148.

［26］鄭國慶，王艷.風(fēng)藥治血與中風(fēng)病證治［J］.中國醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2001，16(1):13－17.