艾灸對克羅恩病大鼠結(jié)腸NF－κB p65及TNF－α、IL－1β調(diào)節(jié)作用的研究

魏 凱 張 丹 竇傳字 馬曉芃 楊 玲 吳煥淦 洪 玨 朱 毅 張翠紅劉 婕 吳凌翔 黃 燕

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海，201203;2上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海，200030)

克羅恩病(Crohn's Disease，CD)為炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)的一種，是一種病因不明的慢性非特異性肉芽腫性炎癥性腸?。?－2］。該病多為慢性起病，反復(fù)發(fā)作，遷延不愈。在歐美等發(fā)達國家發(fā)病率較高，在我國的發(fā)病率近年來有升高趨勢［3－4］，預(yù)計今后可能會持續(xù)增高，應(yīng)當(dāng)予以高度重視?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采用氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、抗菌藥物及手術(shù)治療，但藥物不良反應(yīng)和手術(shù)復(fù)發(fā)率高是當(dāng)今難點［5］。針灸治療CD具有一定的優(yōu)勢，臨床研究顯示針灸療法治療輕中型CD具有確切療效［6－7］，能顯著改善CD患者的全身癥狀，減少腹瀉次數(shù)，降低CD活動指數(shù)［8］，且安全無不良反應(yīng)，值得進一步應(yīng)用和深入研究。

免疫功能異常是CD的主要發(fā)病原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，NF－κB的高表達在CD的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，在CD患者結(jié)腸組織中NF－κB的表達顯著增高［9－10］。細胞內(nèi)激活的NF－κB發(fā)生核移位后可與核內(nèi)的靶基因結(jié)合，引起多種促炎基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進炎癥因子(TNF － α、IL －1β)等的表達［11］。因此，本研究建立CD大鼠模型，觀察隔藥灸對CD大鼠結(jié)腸NF－κB p65及炎癥因子TNF－α、IL－1β表達的影響，為艾灸治療CD療效機制的闡明提供科學(xué)實驗資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性清潔級SD大鼠60只，體重(150±10)g，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供(合格證號:SCXK(滬)2009－0019)。飼養(yǎng)條件:清潔級，室內(nèi)溫度18～22℃，相對濕度50% ～70%，自由攝取飲水、食物。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，觀察大鼠飲食、活動正常后開始實驗。SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、西藥組和隔藥灸組，每組15只。

1.2 主要儀器與試劑 組織脫水機(德國萊卡公司)、包埋機(德國萊卡公司)、切片機(德國萊卡公司);5%(w/v)2，4，6 － 三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma公司);兔抗大鼠TNF－α一抗(武漢博士德公司)，IL－1β一抗(Santa Cruz、Envison/HRP)，NF － κB p65(A)一抗(Santa Cruz、Envison/HRP);美沙拉秦腸溶片(德國Losan Pharma GmbH)。

1.3 模型制備 模型制備參照國際公認的Morris法［12］，應(yīng)用TNBS合乙醇溶液造模。造模開始前禁食、不禁水24 h，稱重后以生理鹽水配制的1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)行腹腔注射麻醉。將無水乙醇加雙蒸水配成50%乙醇，然后將5%(W/V)的TNBS與50%乙醇按照體積比2∶1混合成TNBS灌腸液，造模大鼠以TNBS灌腸液3 mL/kg(TNBS用量為100 mg/kg)灌腸。灌腸針連接注射器，并抽取適當(dāng)灌腸液，大鼠體位為頭下尾上，灌腸時將灌腸針緩緩插入大鼠肛門6～8 cm，注入灌腸液，拔出灌腸針以后再將大鼠倒立1 min，以防藥液溢出。每7 d重復(fù)灌腸1次，共4次。造模結(jié)束后，每組隨機抽取1只大鼠，取其結(jié)腸做HE染色以確定模型制備是否成功。

1.4 分組與治療 隔藥灸組:取穴為天樞(雙)、氣海。采用隔藥餅灸，藥餅配方為附子、肉桂、丹參等藥研末，灸前用黃酒調(diào)和并用自制動物專用模具制成藥餅。艾炷選精制艾絨約90 mg，制成小椎體狀，每次每穴各灸2壯，每日隔藥餅灸1次，共灸7次。

西藥組:采用美沙拉秦灌胃治療。將美沙拉秦腸溶片研末，用雙蒸水配制成灌胃液，每日投藥量按成人(70 kg體重，4 g/d)與大鼠(200 g體重)56∶1的比例［13］，每日1 次，共灌胃7 次。

模型組與正常組不進行任何治療，只作與隔藥灸組相同的抓取與固定。

1.5 指標檢測

1.5.1 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化。

1.5.2 結(jié)腸組織 NF－κB p65及TNF－α、IL－1β表達的測定 采用免疫組織化學(xué)Envision法檢測，并進行圖像分析。主要包括以下步驟。1)結(jié)腸組織石蠟塊4 μm常規(guī)切片，于推片機水面上展片、撈片之后置烤片機上60℃烤片2～3 h。2)常規(guī)脫蠟水化:將石蠟切片浸于二甲苯中5 min×3次，無水乙醇3 min×2次，90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各3 min，之后PBS沖洗3 min×3次。3)抗原修復(fù):切片置于檸檬酸鹽緩沖液中，微波爐內(nèi)以中高火加熱至沸騰，室溫下放置5 min后再加熱至沸騰1次，然后室溫下自然冷卻，之后切片用PBS沖洗3 min×3次。4)消除內(nèi)源性過氧化物酶:滴加以PBS稀釋的3%過氧化氫(H2O2)于組織上，避光孵育20 min。用PBS沖洗3 min×3次。5)滴加一抗:滴加50 μL適當(dāng)濃度的一抗于組織上，4℃冰箱過夜。之后于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)溫45 min，PBS沖洗5 min×3次。6)滴加二抗:滴加1滴二抗工作液于組織上，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次。7)DAB顯色:滴加50μLDAB工作液于組織上，室溫孵育，光鏡下控制顯色時間。顯色完全后，用雙蒸水沖洗終止顯色。8)復(fù)染:切片置蘇木素內(nèi)染色2.5 min，流水沖洗10 min，1%鹽酸酒精分化5 s，之后再流水沖洗10 min返藍。9)脫水、透明、封片:切片置70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、無水乙醇中各3 min，二甲苯5 min×2次，中性樹膠封片，并于光學(xué)顯微鏡下觀察。10)數(shù)據(jù)采集:在固定光亮度下，每張切片隨機選取5個視野拍攝照片，通過Image－Plus Pro 6.0軟件分析并獲取每張照片的陽性目標積分光密度，取平均值即為該切片的陽性目標積分光密度。

1.6 統(tǒng)計分析方法 實驗數(shù)據(jù)通過SPSS15.0進行統(tǒng)計分析，對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的資料采用(s)的形式表示;不符合正態(tài)分布的資料采用Median(min～max)的形式表示。若各組方差齊等，直接采用單因素方差分析(One－Way ANOVA)進行檢驗，檢驗結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義則進一步采用LSD檢驗做兩兩比較;若各組方差不齊，采用非參數(shù)檢驗的Kruskal－Wallis H檢驗分析，檢驗結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義則進一步采用Nemenyi法進行兩兩比較。統(tǒng)計檢驗水準均為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化 光鏡下觀察，正常組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜上皮連續(xù)覆蓋，表面可見紋狀緣，黏膜固有層單層杯狀細胞、腺腔排列整齊，黏膜下層為疏松結(jié)締組織，可見成纖維細胞、膠原纖維、血管、脂肪細胞及少量淋巴細胞，未見水腫或增生，腸壁肌層、漿膜層分布清晰。模型組腸道炎癥明顯，黏膜表面潰瘍形成，局部黏膜上皮層缺失，裂隙狀潰瘍形成，固有層間質(zhì)、黏膜下層結(jié)締組織明顯水腫伴大量淋巴細胞、嗜酸性粒細胞浸潤，黏膜下層可見成團單核巨噬細胞聚集，偶見結(jié)節(jié)病樣肉芽腫形成，伴有大量纖維組織增生，局部黏膜固有層杯狀細胞增生明顯，腺腔排列紊亂，腸壁肌層、漿膜層分布尚清晰，提示克羅恩病模型制備成功。西藥組可見愈合性潰瘍形成，結(jié)腸黏膜腺體排列較整齊，黏膜層可見炎性細胞、嗜酸性粒細胞浸潤，黏膜下層有水腫、增厚及炎性細胞浸潤，腸壁黏膜下層、肌層及漿膜層分布清晰。隔藥灸組可見愈合性潰瘍，輕度充血水腫，黏膜上皮覆蓋完整，黏膜固有層明顯增厚，可見炎性細胞浸潤，大量杯狀細胞增生，單層杯狀細胞、腺腔排列尚整齊，黏膜下層結(jié)締組織輕度水腫，可見脂肪細胞、成纖維細胞、少量膠原纖維及淋巴細胞浸潤，腸壁肌層、漿膜層分布清晰。提示，隔藥灸組和西藥組對CD大鼠腸道炎癥、組織形態(tài)結(jié)構(gòu)具有一定的改善作用。

2.2 結(jié)腸組織NF－κB p65免疫組化染色結(jié)果 由圖1可見，NF－κB p65在正常組僅少量表達于結(jié)腸黏膜間質(zhì)內(nèi)的淋巴細胞、單核/巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi);在模型組的表達顯著高于正常組，多表達于黏膜間質(zhì)內(nèi)的淋巴細胞、單核/巨噬細胞胞質(zhì)和胞核內(nèi);西藥組和隔藥灸組表達均接近正常組，少量表達于黏膜間質(zhì)內(nèi)的淋巴細胞、單核/巨噬細胞胞質(zhì)和胞核內(nèi)。圖像分析的結(jié)果顯示，模型組NF－κB p65的表達較正常組顯著增高(P＜0.01)，隔藥灸與西藥治療后，均能顯著降低CD模型大鼠結(jié)腸組織NF－κB p65的表達(P＜0.01)。

圖1 各組大鼠結(jié)腸NF－κB p65免疫組化染色結(jié)果

表1 各組大鼠結(jié)腸NF－κB p65免疫組化染色積分光密度(s)

表1 各組大鼠結(jié)腸NF－κB p65免疫組化染色積分光密度(s)

注:與正常組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，△△P＜0.01。

10 620.37±434.30模型組 10 4322.09±2740.90＊＊西藥組 10 674.03±209.86△△隔藥灸組 10 744.20±272.53 B p65正常組組別 鼠數(shù) NF－κ△△

圖2 各組大鼠結(jié)腸TNF－α免疫組化染色結(jié)果

2.3 結(jié)腸組織TNF－α、IL－1β免疫組化染色結(jié)果由圖2可見，TNF－α在正常組僅微弱表達于腸黏膜上皮細胞胞質(zhì);在模型組強表達于腸黏膜上皮細胞和黏膜間質(zhì)內(nèi)的淋巴細胞、單核/巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi);西藥組TNF－α表達較弱，接近正常組;隔藥灸組TNF－α表達較模型組明顯減弱，表達于腸黏膜上皮細胞和黏膜間質(zhì)淋巴細胞、單核/巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)。由圖3可見:正常組IL－1β僅微弱表達于腸黏膜上皮細胞胞質(zhì)，少量表達于黏膜間質(zhì)內(nèi)淋巴細胞、單核/巨噬細胞胞質(zhì);模型組IL－1β表達較正常組顯著增強，主要表達于腸黏膜上皮細胞、腺上皮細胞和黏膜間質(zhì)內(nèi)的淋巴細胞、單核/巨噬細胞胞質(zhì);西藥組和隔藥灸組IL－1β較模型組顯著降低，僅少量表達于腸黏膜上皮細胞、腺上皮細胞和間質(zhì)內(nèi)淋巴、單核/巨噬細胞胞質(zhì)。圖像分析結(jié)果顯示:模型組TNF－α、IL－1β的表達較正常組均顯著增高(P＜0.01)，西藥與隔藥灸治療均能降低CD模型大鼠結(jié)腸組織 TNF－α(P＜0.01)、IL－1β(P＜0.05，P ＜0.01)的表達。

圖3 各組大鼠結(jié)腸IL－1β免疫組化染色結(jié)果

表2 各組大鼠結(jié)腸TNF－α、IL－1β免疫組化染色積分光密度

表3 TNF－α、IL－1β與NF－κB p65表達的相關(guān)性Median(min～max)

2.4 結(jié)腸TNF－α、IL－1β與NF－κB p65表達的相關(guān)性分析 由表3、圖4－5可知:大鼠結(jié)腸組織炎癥因子TNF－α、IL－1β的表達與NF－κB p65的表達均呈正相關(guān)性。

圖4 TNF－α與NF－κB p65表達的相關(guān)性

圖5 IL－1β與NF－κB p65表達的相關(guān)性

3 討論

中醫(yī)學(xué)中并無克羅恩病的專屬名詞，根據(jù)其病因病機及其臨床癥狀可將其歸屬為中醫(yī)學(xué)的腸癖、久痢、便血、滯下、腹痛等范疇。本課題組自2000年開始，從臨床與實驗兩個方面較為深入地開展了針灸治療克羅恩病的專項研究。采用天樞、氣海為主穴隔藥灸治療輕、中型CD，近期有效率達72.7%［14］;在臨床有效的基礎(chǔ)上，開展了一系列的基礎(chǔ)實驗研究，采用三硝基苯磺酸(TNBS)制備實驗性CD大鼠模型［15］，探討針灸治療CD的作用機制。研究結(jié)果顯示針灸能顯著改善CD模型大鼠腸組織病理損傷，降低血清TNF－α，降低腸黏膜異常增高的TNF－α、TNFR1、TNFR2，下調(diào)結(jié)腸TGF － β、FGF、CTGF、IGF －I、IGF －IR、IGFBP －5 的異常表達，從而減輕CD腸道炎癥，改善組織損傷和腸纖維化，發(fā)揮治療作用［6，16－20］。上述研究顯示針灸對 CD具有良好的干預(yù)作用，值得進一步深入研究和應(yīng)用。

NF－κB/Rel家族共有5個成員，分別是 RelA/p65，c－ Rel，RelB，NF － κB1(p105/p50)和 NF － κB2(p100/p52)［11，21］。NF － κB/Rel多以 5 個亞單位組成的同質(zhì)或異質(zhì)二聚體的形式存在，其中p50/p65異質(zhì)二聚體(即NF－κB)最為常見。p50亞單位介導(dǎo)NF－κB與DNA上的κB序列的結(jié)合，p65亞單位可以利用其C端反式激活域增強靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，并介導(dǎo)IκB的激活。在未受刺激的細胞內(nèi)，NF－κB的異質(zhì)二聚體與抑制蛋白IκB結(jié)合形成三聚體，以失活狀態(tài)存在于胞質(zhì)內(nèi)。外界刺激信號可通過一系列反應(yīng)磷酸化并降解IκB，從而暴露NF－κB的核定位序列(NLS)，并使其激活。激活的NF－κB發(fā)生核移位，通過p50亞單位的NLS與核內(nèi)靶基因啟動子區(qū)域的κB序列結(jié)合，誘導(dǎo)促炎基因的轉(zhuǎn)錄，在免疫反應(yīng)、炎癥、細胞凋亡和細胞增殖中發(fā)揮重要作用［22］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)NF－κB在IBD(CD和UC)的發(fā)病和進展中起著尤為重要的作用［23］。在IBD患者腸道黏膜巨噬細胞及上皮細胞中有大量被激活的 NF－κB［24］，可以調(diào)節(jié)與IBD發(fā)生發(fā)展相關(guān)的促炎性細胞因子(TNF－α、IL－1β、IL－6等)的產(chǎn)生和釋放，加重腸道的炎性反應(yīng)。NF－κB p65亞單位在CD和UC患者腸黏膜組織中的表達明顯上調(diào)，且在 CD 患者中尤為明顯［25－26］，免疫組織化學(xué)染色表明CD中活化的NF－KB主要定位于黏膜固有層單核細胞及巨噬細胞內(nèi)，但黏膜下表皮細胞和內(nèi)皮細胞中亦可見陽性染色。NF－κB mRNA在脾虛型CD大鼠的表達也顯著升高［27］。NF－κB p65 siRNA對DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型有保護效應(yīng)，利用NF－κB p65 siRNA靶向阻斷NF－κB途徑可能成為IBD基因治療的新方法［28］。以上研究結(jié)果均提示，NF－κB與CD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有效抑制NF－κB的表達，能夠降低炎性因子的分泌，改善組織損傷。

TNF－α、IL－1β均為重要的促炎因子。TNF－α主要由活化的單核細胞、T細胞、巨噬細胞產(chǎn)生，在CD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，不但可以引起炎癥細胞在腸道的聚集，增加結(jié)腸上皮細胞的滲透性，引發(fā)炎癥、水腫和肉芽腫形成，還可誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細胞的凋亡［29－30］。IL－1β 主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生，在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮介質(zhì)作用，具有多種生物學(xué)功能，它不僅能促使中性粒細胞活化、巨噬細胞脫顆粒以及炎癥因子的釋放，還能增加上皮細胞及內(nèi)皮細胞的通透性，引起一系列腸道炎癥反應(yīng)和組織破壞［31－32］。在IBD的發(fā)病中，NF－κB靶基因的表達失調(diào)，會引起TNF－α、IL－1β 等炎癥因子的高表達［4］。高表達的炎癥因子又可作為NF－κB信號通路的啟動因子，進一步促進該通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并誘導(dǎo)更多NF－κB的激活，對該通路起正向放大作用，加重炎癥反應(yīng)。以上研究提示，NF－κB與TNF－α、IL－1β均為CD發(fā)病中的關(guān)鍵因子，因此本文觀察艾灸對NF－κB p65與TNF－α、IL－1β的調(diào)節(jié)作用以進一步闡釋艾灸治療克羅恩病的免疫機制。

本研究結(jié)果顯示，CD模型大鼠結(jié)腸組織NF－κB p65的表達顯著增高，且多表達于黏膜間質(zhì)內(nèi)的淋巴細胞、單核/巨噬細胞胞質(zhì)和胞核內(nèi)，隔藥灸治療后，CD大鼠結(jié)腸病理形態(tài)學(xué)顯著改善，腸道炎癥減輕，NF－κB p65的表達亦顯著降低，提示NF－κB p65與CD發(fā)病密切相關(guān)，降低NF－κB p65的表達是隔藥灸治療CD的重要機制。研究還發(fā)現(xiàn)，隔藥灸能顯著降低CD模型大鼠結(jié)腸組織中顯著增高的炎癥因子TNF－α、IL－1β的表達;TNF－α、IL－1β均為 NF－κB p65的下游炎癥因子，進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)TNF－α、IL－1β的表達與NF－κB p65的表達呈正相關(guān)，提示抑制CD大鼠結(jié)腸NF－κB p65的表達，進而減少其下游炎癥因子TNF－α、IL－1β的表達，從而減輕腸道炎癥，改善結(jié)腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，可能是艾灸(隔藥灸)治療CD的重要效應(yīng)機制。NF－κB的激活涉及IκB的磷酸化，而后者有賴于 IKK(IκB 激酶)的調(diào)控，IKK/IκB/NF － κB 是一個有機聯(lián)系的系統(tǒng)，繼續(xù)深入研究CD IKK/IκB/NF－κB信號傳導(dǎo)途徑和艾灸對其調(diào)節(jié)作用，有助于進一步闡明艾灸治療CD的效應(yīng)機制。

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