高效液相色譜法測定人纖維蛋白原中甘氨酸、鹽酸精氨酸含量

陳通威，高紅琴，崔素梅，張惠蘭，王宗剛

(山西康寶生物制品股份有限公司，山西 長治 046011)

人纖維蛋白原主要是作為凝血因子Ⅰ而直接參與凝血過程[1]，是由健康人血漿經(jīng)低溫乙醇法分離提取后，再經(jīng)病毒去除和滅活處理，最后凍干制成。凍干過程是一個復(fù)雜的相變過程，在凍結(jié)、凍融、干燥和儲存過程中存在著多種影響因素[2]。而凍干保護劑是影響制品凍干效果的主要因素[3]。甘氨酸、鹽酸精氨酸是一種理想的蛋白保護劑。本試驗中旨在建立一種含量測定方法，用于生產(chǎn)過程中甘氨酸、鹽酸精氨酸含量的監(jiān)控及成品的檢定。

1 儀器與試藥

P2000型高效液相色譜儀)，OV－2001型柱溫箱(美國TSP公司);UV1000型紫外檢測儀(美國TSP公司);LDZS－Z型臺式離心機(北京醫(yī)用離心機廠)。甘氨酸對照品(批號為624－200104)、鹽酸精氨酸對照品(批號為624－200104)、天門冬氨酸對照品(批號為624－200104)均來自中國藥品生物制品檢定所;乙腈，三乙胺，正己烷，異硫氰酸苯酯，磺基水楊酸，鹽酸，醋酸鈉，乙腈為色譜級，其余試劑為分析純。1mol/L三乙胺乙腈溶液，0.1mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液，1.5%磺基水楊酸溶液，0.1 mol/L 鹽 酸 溶 液 ;樣 品 (批 號 為 20100101，20100102，20100203，山西康寶生物制品股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[4－7]與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Kromisil C18柱(250mm ×4.6mm，5μm);流動相:A為 0.1 mol/L醋酸鈉(pH=6.5)－ 乙腈(93∶7)，B 為乙腈 － 水(4∶1)，梯度洗脫(表1);進樣量:20μL;柱溫:38℃;檢測波長:254 nm;流速:1.0mL/min。理論板數(shù)按鹽酸精氨酸峰計算應(yīng)不低于3000。在此色譜條件下甘氨酸、鹽酸精氨酸峰與其它色譜峰之間分離度良好。從色譜圖1A可知，甘氨酸峰保留時間為7.590min，鹽酸精氨酸峰保留時間為8.041min，內(nèi)標(biāo)物天門冬氨酸峰保留時間為4.028min。按鹽酸精氨酸峰計算理論板數(shù)為29 697，甘氨酸、鹽酸精氨酸與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的分離度符合要求。從色譜圖1B可知，甘氨酸、鹽酸精氨酸與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰及其他雜質(zhì)峰的分離度符合要求。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2 溶液制備

分別稱取甘氨酸、鹽酸精氨酸對照品適量，精密稱定，置同一量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液制成每1mL約含甘氨酸、鹽酸精氨基酸0.6mg的溶液，得對照品溶液。稱取內(nèi)標(biāo)物天門冬氨酸適量，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶液制成每1 mL中約含天門冬氨酸2 mg的溶液，得內(nèi)標(biāo)溶液。精密量取復(fù)溶后的樣品1 mL，加1.5%磺基水楊酸溶液9mL，混勻，靜置30min，以3000 r/min離心10min，取上清液，用0.1mol/L鹽酸溶液稀釋5倍，得供試品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 測定法

分別精密量取對照品溶液和供試品溶液各100μL，置離心管中，依次各加 0.1 mol/L鹽酸溶液200μL，內(nèi)標(biāo)溶液 50μL，0.1mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液50μL，1mol/L三乙胺乙腈溶液50μL，混勻，室溫放置1 h，加入正己烷400μL，搖勻，靜置10 min，取下層溶液，濾過，即得衍生化的對照品溶液和供試品溶液。精密量取衍生化的對照品溶液與供試品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計算，即得。精密量取對照品溶液100μL，按上述方法衍生處理，進樣。

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:分別精密量取對照品溶液30，50，70，100，130μL，各加0.1mol/L鹽酸溶液適量，衍生，進樣，記錄色譜圖。以氨基酸的質(zhì)量濃度 C(g/L)為橫坐標(biāo)、峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(f)為縱坐標(biāo)回歸計算。甘氨酸回歸方程為 Y=3.413 2X－0.071 6，r2=0.996 8;鹽酸精氨酸回歸方程為 Y=0.978 7X －0.039 9，r2=0.998 2。結(jié)果表明，甘氨酸在 0.186 8 ～0.809 4 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，甘氨酸測定質(zhì)量濃度為0.4 g/L，在線性范圍之內(nèi);鹽酸精氨酸在0.186 3～0.807 3 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，鹽酸精氨酸測定質(zhì)量濃度為0.6 g/L，在線性范圍之內(nèi)。

精密度試驗:精密量取對照品溶液100μL，按上述方法衍生處理，連續(xù)進樣5次。分別測得甘氨酸、鹽酸精氨酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(f)。結(jié)果甘氨酸 RSD為1.37%，鹽酸精氨酸 RSD為0.88%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取批號為20100101的供試品1份，按供試品溶液制備方法制樣、衍生，室溫下放置，分別在0，2，4，8 h時進樣，分別測得甘氨酸、鹽酸精氨酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(f)。結(jié)果甘氨酸 RSD為1.51%，鹽酸精氨酸 RSD為1.94%，表明溶液穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗:取批號為20100101的供試品，精密加入處方量80%，110%，115%的甘氨酸、鹽酸精氨酸，混勻，稀釋1倍，分別精密量取100μL，衍生化后，每份進樣20μL，計算樣品回收率。結(jié)果見表2。

表2 甘氨酸與鹽酸精氨酸加樣回收試驗測定結(jié)果(n=6)

重現(xiàn)性試驗:取 3批樣品(批號為 20100101，20100102，20100203)，在不同時間，不同實驗室間進行重現(xiàn)性試驗。結(jié)果甘氨酸 RSD分別為1.9%，1.8%，1.9%，鹽酸精氨酸 RSD分別為1.4% ，1.6%，1.7% ，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.5 樣品含量測定

取3批樣品，依法測定，計算含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果(g/L)

3 討論

目前國內(nèi)外報道的測定甘氨酸、鹽酸精氨酸含量的高效液相色譜法有多種，但多為僅測定1種氨基酸的方法。按2010年版《中國藥典(三部)》的方法，所用的化學(xué)組件包價格昂貴，高效液相需要三泵，檢測成本較高，相對于規(guī)模較小的單位，其應(yīng)用受到制約。

高效液相色譜柱前衍生化法有多種衍生劑可供使用。預(yù)試驗結(jié)果表明，利用異硫氰酸苯酯乙腈溶液和三乙胺乙腈溶液柱前衍生反相高效液相色譜法測定人纖維蛋白原中甘氨酸、鹽酸精氨酸含量，分離效果較佳，保留時間適宜。該方法簡便可靠，專屬性好，重現(xiàn)性好，適用性較強，且試驗材料便宜、易得，可以作為人纖維蛋白原中甘氨酸、鹽酸精氨酸含量的測定方法。

[1]徐修才，吳競生，翟志敏.人纖維蛋白原的研究進展[J].國外醫(yī)學(xué):臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊，2004，25(6):503－505.

[2]孫東坡，胡一橋.蛋白質(zhì)冷凍干燥制品中的保護劑及其保護機制[J].藥學(xué)進展，2003，27(4):202 －205.

[3]劉占杰，華澤釗.蛋白質(zhì)藥品冷凍干燥過程中變性機理的研究進展[J].中國生化藥物雜志，2000，21(5):263－265.

[4]楊昭鵬，曾文珊，楊曉暉，等.腦蛋白水解物注射液的質(zhì)量研究Ⅱ[J].藥物分析雜志，2003，23(2):106－108.

[5]李愛菊，鄭宏強，熊愛琴.小牛血去蛋白提取物注射液中游離氨基酸的含量測定[J].中國藥業(yè)，2006，15(7):40.

[6]趙艷紅，王 強，陳兆梅.柱前衍生化HPLC法測定人纖維蛋白原中精氨酸的含量[J].藥學(xué)實踐雜志，2006，24(5):270－271.

[7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(三部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄41.