人溶血磷脂酸受體1基因的克隆、表達載體構(gòu)建及瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞

李鐵威 趙鵬飛 馬潔 阿拉坦高勒

人溶血磷脂酸受體1（LPAR1）是G-蛋白偶聯(lián)受體家族、EDG亞家族成員（EDG family）［1-3］，LPAR1在人體正常組織中普遍表達并可在溶血磷脂酸（Lysophosphatidic Acid，LPA）的誘導(dǎo)下與 Gi、Gq、G12/13偶聯(lián)介導(dǎo)諸多的細胞生理反應(yīng)，如細胞增殖、分化、血小板凝集以及在腫瘤細胞中促進細胞的能動性、遷移等生物活性［4-8］。人的LPAR1基因位于人基因的9q31.3區(qū)，CDS區(qū)長1095bp，編碼364個氨基酸形成七次疏水跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，分子量大約為 41kD［7，9-11］。LPAR1能夠感知細胞外LPA的刺激與Gi蛋白偶聯(lián)抑制cAMP的生成［9］。隨著對LPAR1介導(dǎo)的信號通路的深入研究發(fā)現(xiàn)，LPAR1可能參與細胞增殖與遷移及其相關(guān)疾病過程［3，12，13］。為進一步研究 LPAR1參與動脈硬化、腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展及遷移等問題，本研究克隆了LPAR1基因并構(gòu)建表達載體，瞬時轉(zhuǎn)染細胞，檢測細胞內(nèi)cAMP的積累，旨在為進一步研究溶血磷脂酸受體LPAR1的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗細胞及主要試劑 人胃癌細胞BGC803（本研究室保存）。限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ、XhoⅠ、DNase及T4DNA連接酶（Thermo Scientific公司）；TranStart Taq DNA polymerase（北京全式金公司）；總RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒（上海生工生物有限公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；DMEM高糖（Gibco公司）；胰酶（Hyclone公司）；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（Invitrigen公司）；DNA分子量標準（北京中科瑞泰公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）、實時定量試劑盒（北京康為世紀），pCR2.1載體（Invitrogen公司）；pIRES2-EGFP（Clontech）；293T細胞（本研究室保存），LPA（Sigma），ISP（Isoproterenol，異丙腎上腺素，Sigma），ELISA 試劑盒（AAT Bioquest），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器 PCR 儀為ABI公司產(chǎn)品，凝膠電泳儀和熒光定量PCR儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品，熒光倒置顯微鏡為尼康公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 LPAR1基因的克隆 從人胃癌細胞BGC-803提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物為模板，基因庫查找編碼人LPAR1的mRNA序列，用primer 5軟件設(shè)計引物，序列如下：上游引物P1：5'-CTCGAGATGGCTGCCATCTCTACTTC-3'，下游引物P2：5'-GGATCCCTAAACCACAGAGTGGTCATTG-3'（上海生工生物有限公司合成），其中下劃線為XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點；擴增長度1107bp。PCR 反應(yīng)體系 ：上游引物（10μmol/L）1.5μL，下游引物（10μmol/L）1.5μL，雙蒸水 31.5μL，10×GC Enhance 5μL，dNTPs（各 2.5mmol/L）4μL，10×TranStart Taq Buffer 5μL，TranStart Taq DNA polymerase 0.5μL，模板 1μL。反應(yīng)條件 ：94℃預(yù)變性5min；94℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 60s，30個循環(huán)；最后再于72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，純化回收 PCR產(chǎn)物，回收產(chǎn)物與pCR2.1載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，藍白斑篩選陽性（pCR2.1-LPAR1）克隆，送測序。

1.2.2 構(gòu)建表達載體 用XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切pCR2.1-LPAR1與pIRES2-EGFP載體，酶切產(chǎn)物回收后用T4 DNA連接酶在16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆PCR鑒定，送測序。

1.2.3 瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞 293T細胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，胰酶消化制成單細胞懸液，以 2×105個/孔接種于6孔板。提取并純化pIRES2-EGFP-LPAR1和pIRES2-EGFP質(zhì)粒，用NanoDrop 核酸蛋白測定儀nd1000測定質(zhì)粒濃度和純度，分別轉(zhuǎn)染293T細胞。24h后觀察熒光照相，36h提取細胞總RNA。

1.2.4 實時定量PCR檢測目的基因的表達 收集未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染上述2種質(zhì)粒的293T細胞，用總RNA提取試劑盒提取各組細胞的總RNA，再用DNA酶Ⅰ去除RNA中可能殘余的基因組DNA，NanoDrop核酸蛋白測定儀nd1000檢測濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。GoldStar TaqMan Mixture 康為世紀試劑盒用來實時定量PCR檢測目的基因在各組細胞中的表達。所用引物如下：LPAR1基因檢測引物，上游引物：5'-CGTCAGGGCCTCATTGACA-3'，下游引物：5'-GTGCCTCTCGATTGCAATAGC-3'，LPAR1基因探針序列：5'-CCTGACGGCATCTGTGGCCAACTTA-3'；以GAPDH基因為內(nèi)參，上游引物：5'-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTTC-3'，下游引物5'-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'，GAPDH基因 探 針 序 列：5'-ACAGCGACACCCACTCCTCCACCTT-3'；反應(yīng)體系：2×GoldStar TaqMan Mixture 25μL， 上 下 游 引 物（10μmol/L）各 1μL，探針（Probe）1μL，DNA 模板 2μL，RNase-Free Water 20μL，共 50μL。反應(yīng)條件 ：95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃（LPAR1）和60℃（GAPDH）退火1min，循環(huán)39次；每個反應(yīng)有3次重復(fù)。

1.2.5 ELISA檢測LPA刺激下的cAMP含量 用ELISA試劑盒所給cAMP標準品制作標準曲線，LPA和ISP刺激轉(zhuǎn)染空載體（pIRES2-EGFP）和插入LPAR1基因載體（pIRES2-EGFP-LPAR1）的細胞4min然后用1mol/L HCl終止反應(yīng)；裂解細胞收集胞內(nèi)cAMP。用ELISA試劑盒在熒光激發(fā)波長540nm和發(fā)射波長590nm處檢測LPA和ISP刺激下胞內(nèi)cAMP的積累量。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計學(xué)軟件one-way ANOVA進行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果

2.1 LPAR1編碼區(qū)片段的克隆與序列測定

用引物P1、P2以 cDNA為模板擴增得到與預(yù)期片段大小相符的特異性片段（圖1）?；厥盏腜CR產(chǎn)物與pCR2.1載體連接成的重組質(zhì)粒pCR2.1-LPAR1經(jīng)酶切鑒定正確（圖2）。序列測定結(jié)果表明，擴增出的cDNA片段長1107bp，與已知的NCBI 基因庫中人LPAR1（NM_001401）序列完全一致。

圖1 LPAR1的PCR瓊脂糖電泳結(jié)果

圖2 pCR2.1-LPAR1酶切鑒定電泳結(jié)果

2.2 表達載體pIRES2-EGFP-LPAR1的構(gòu)建

獲得的重組質(zhì)粒pCR2.1-LPAR1和表達載體質(zhì)粒 pIRES2-EGFP 經(jīng) XhoⅠ+BamHⅠ雙酶切（圖 3），再將LPAR1（1107bp）片段與pIRES2-EGFP酶切產(chǎn)物連接，得到的表達載體pIRES2-EGFP-LPAR1，經(jīng)XhoⅠ+BamHⅠ雙酶切pIRES2-EGFP及pIRES2-EGFP-LPAR1鑒定與預(yù)期序列大小相符。

圖3 pIRES2-EGFP-LPAR1酶切鑒定電泳結(jié)果

2.3 轉(zhuǎn)LPAR1基因293T細胞檢測

pIRES2-EGFP-LPAR1 轉(zhuǎn)染293T細胞24h后觀察熒光（圖4），統(tǒng)計陽性細胞，轉(zhuǎn)染率約為61％。

圖4 轉(zhuǎn)染24h后觀察圖（100×）

2.4 實時定量PCR檢測LPAR1基因在293T細胞中的表達

LPAR1基因的表達檢測，分別提取未轉(zhuǎn)染細胞、轉(zhuǎn)染空載體（pIRES2-EGFP）的細胞和轉(zhuǎn)染插入LPAR1片段載體的細胞中總RNA并去除其中的基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以實時定量PCR法檢測LPAR1基因的表達，檢測到LPAR1基因表達水平顯著提高，與未轉(zhuǎn)染的細胞比較mRNA 表達提高71倍（圖5）。

圖5 pIRES2-EGFP-LPAR1轉(zhuǎn)染后的293T細胞中LPAR1基因相對表達量檢測

2.5 ELISA檢測轉(zhuǎn)基因細胞的cAMP含量

cAMP的檢測用10μmol/L LPA分別刺激轉(zhuǎn)染空載體（pIRES2-EGFP）的細胞和轉(zhuǎn)染插入LPAR1基因片段載體后的細胞并用1mol/L HCl終止反應(yīng)，裂解細胞收集細胞裂解液，用ELISA試劑盒檢測cAMP的含量，檢測到轉(zhuǎn)染LPAR1基因的細胞cAMP降低（與轉(zhuǎn)染空載體的細胞比較）（圖6）。ISP（Isoproterenol，異丙腎上腺素）能夠刺激促進cAMP的產(chǎn)生，在1μmol/L ISP的存在下混以不同濃度的LPA刺激轉(zhuǎn)染LPAR1基因的細胞，檢測到胞內(nèi)cAMP的積累量隨著LPA濃度的升高而降低（圖7）。

圖6 LPA刺激轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-LPAR1后的293T細胞中cAMP表達量檢測

圖7 LPAR1轉(zhuǎn)基因細胞中不同濃度LPA刺激后cAMP含量檢測

3 討論

LPA是在血漿、血清、組織液及腦組織等體液與組織中廣泛存在的生理活性磷脂小分子［14］，在體內(nèi)有著廣泛的生物學(xué)作用，如，細胞增殖、細胞運動等；同時，LPA通過LPAR1與結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、動脈粥樣硬化、神經(jīng)性疼痛等疾病密切相關(guān)［13，15-19］。LPA 通過 LPAR1偶聯(lián) Gi蛋白的信號通路抑制 cAMP 的產(chǎn)生［4，7，16］。為了詳細研究人溶血磷脂酸受體LPAR1的功能以及其介導(dǎo)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，本試驗克隆了人的LPAR1基因以及構(gòu)建真核表達載體質(zhì)粒pIRES2-EGFP-LPAR1，用脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞，發(fā)現(xiàn)293T細胞具有極低量的LPAR1基礎(chǔ)表達。轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFPLPAR1后，293T細胞的LPAR1mRNA表達提高71倍（與未轉(zhuǎn)染的細胞比較）。通過檢測LPA刺激轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-LPAR1的細胞cAMP的含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-LPAR1的細胞cAMP的含量低于轉(zhuǎn)染空載體（pIRES2-EGFP）的細胞，證實了該轉(zhuǎn)基因細胞成功表達了活性的LPAR1蛋白，能夠滿足于進一步的試驗需要。又通過在1μmol/L ISP（Isoproterenol）和濃度梯度的LPA共刺激LPAR1轉(zhuǎn)基因細胞發(fā)現(xiàn)LPA可以劑量依賴性的抑制cAMP的形成，且存在著線性關(guān)系。

本研究采用瞬時轉(zhuǎn)染LPAR1基因，獲得約為61％的轉(zhuǎn)染細胞，此時細胞基因表達相比未轉(zhuǎn)染的細胞便高出71倍，說明本試驗成功構(gòu)建得到LPAR1基因的真核表達質(zhì)粒；此外當細胞群中有61％的細胞高表達LPAR1時細胞應(yīng)答所造成的差異便具有很高的顯著性，而實際當所有細胞均高表達LPAR1時所造成的差異應(yīng)該比此更加明顯。Gerrard等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在激活血小板的過程中檢測到多種分子形態(tài)的LPA分子，?；鶡N鏈的C原子數(shù)和脂肪酸的飽和度不同使LPA具有不同的分子結(jié)構(gòu)。隨后研究發(fā)現(xiàn)不同分子形態(tài)的LPA活化LPAR1受體的能力不同且在一定程度上存在著拮抗效應(yīng)，其共同作用發(fā)揮其所介導(dǎo)的下游信號通路功能［21］，因此通過普通的方法檢測活化LPAR1受體的LPA濃度存在一定的難度，需要進一步的深入研究。

4 結(jié)論

克隆LPAR1基因并構(gòu)建LPAR1基因的真核表達質(zhì)粒pIRES2-EGFP-LPAR1，瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞獲得LPAR1轉(zhuǎn)基因細胞模型，LPAR1基因得以高表達。此外LPAR1被激活后能強烈抑制由ISP誘導(dǎo)的cAMP積累，其作用具有LPA劑量依賴性。

［1］Barber SC, Mellor H, Gampel A, et al. S1P and LPA trigger Schwann cell actin changes and migration［J］. Eur J Neurosci, 2004, 19（12）：3142-3150.

［2］Okabe K, Hayashi M, Fujii M, et al. Mutations of lysophosphatidic acid receptor genes in human osteosarcoma cells［J］. Pathobiology,2010, 77（5）：278-282.

［3］Kato K, Fukui R, Okabe K, et al. Constitutively active lysophosphatidic acid receptor-1enhances the induction of matrix metalloproteinase-2［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 417（2）：790-793.

［4］Hayashi M, Okabe K, Kato K, et al. Differential function of lysophosphatidic acid receptors in cell proliferation and migration of neuroblastoma cells［J］. Cancer Lett, 2012, 316（1）：91-96.

［5］Kato K, Yoshikawa K, Tanabe E, et al. Opposite roles of LPA（1）and LPA（3）on cell motile and invasive activities of pancreatic cancer cells［J］. Tumour Biol, 2012, 33：1739-1744.

［6］Marshall JC, Collins JW, Nakayama J, et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer［J］. J Natl Cancer Inst, 2012, 104（17）：1306-1319.

［7］Anliker B, Chun J. Lysophospholipid G protein-coupled receptors［J］. J Biol Chem, 2004, 279：20555-20558.

［8］Shida D, Kitayama J, Yamaguchi H, et al. Dual mode regulation of migration by lysophosphatidic acid in human gastric cancer cells［J］. Exp Cell Res, 2004, 301（2）：168-178.

［9］Hecht JH, Weiner JA, Post SR, et al. Ventricular zone gene-1（vzg-1）encodes a lysophosphatidic acid receptor expressed in neurogenic regions of the developing cerebral cortex［J］. J Cell Biol, 1996,135（4）：1071-1083.

［10］Contos JJ, Ishii I, Chun J. Lysophosphatidic acid receptors［J］.Mol Pharmacol, 2000, 58（6）：1188-1196.

［11］An S, Dickens MA, Bleu T, et al. Molecular cloning of the human Edg2 protein and its identification as a functional cellular receptor for lysophosphatidic acid［J］. Biochem Biophys Res Commun,1997, 231（3）：619-622.

［12］Ward Y, Lake R, Yin JJ, et al. LPA receptor heterodimerizes with CD97 to amplify LPA-initiated RHO-dependent signaling and invasion in prostate cancer cells［J］. Cancer Res, 2011, 71：7301-7311.

［13］Lin ME, Herr DR, Chun J. Lysophosphatidic acid（LPA）receptors：signaling properties and disease relevance［J］. Prostaglandins ＆Other Lipid Mediators, 2010, 91（3-4）：130-138.

［14］Saulnier-Blache JS. Lysophosphatidic acid ：a “bioactive”phospholipid［J］. Medecine Sciences：M/S, 2004, 20：799-803.

［15］Blaho VA, Hla T. Regulation of mammalian physiology,development, and disease by the sphingosine 1-phosphate and lysophosphatidic acid receptors［J］. Chemical Reviews, 2011,111：6299-6320.

［16］Harma V, Knuuttila M, Virtanen J, et al. Lysophosphatidic acid and sphingosine-1-phosphate promote morphogenesis and block invasion of prostate cancer cells in three-dimensional organotypic models［J］. Oncogene, 2012, 31：2075-2089.

［17］Matsumoto T, Kobayashi T, Kamata K. Role of lysophosphatidylcholine（LPC）in atherosclerosis［J］. Current Medicinal Chemistry,2007, 14（30）：3209-3220.

［18］Meyer zu Heringdorf D, Jakobs KH. Lysophospholipid receptors：signalling, pharmacology and regulation by lysophospholipid metabolism［J］. Biochim Biophys Acta, 2007, 1768（4）：923-940.

［19］Kitayoshi M, Fukui R, Tanabe E, et al. Different effects on cell proliferation and migration abilities of endothelial cells by LPA1and LPA3in mammary tumor FM3A cells［J］. Journal of Receptor and Signal Transduction Research, 2012, 32（4）：209-213.

［20］Gerrard JM, Robinson P. Identification of the molecular species of lysophosphatidic acid produced when platelets are stimulated by thrombin［J］. Biochim Biophys Acta, 1989, 1001（3）：282-285.

［21］Bandoh K, Aoki J, Taira A, et al. Lysophosphatidic acid（LPA）receptors of the EDG family are differentially activated by LPA species. Structure-activity relationship of cloned LPA receptors［J］. FEBS Letters, 2000, 478（1-2）：159-165.