香蕉枯萎病拮抗放線菌1-g-59的篩選與鑒定

劉小玉 周登博 譚昕 高祝芬 陳波 黃霄 張錫炎

香蕉枯萎病又稱黃葉病、巴拿馬病，是由尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporiumf. sp. cubense）侵染香蕉植株引起的一種毀滅性土傳維管束病害，近年來在中國香蕉主產(chǎn)區(qū)持續(xù)爆發(fā)，嚴重制約著我國香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［1-3］。其病原菌有4個生理小種［4］，其中4號生理小種（Fusarium oxysporium f. sp. cubense 4，F(xiàn)OC4）侵染范圍最廣，幾乎危害所有的香蕉品種，我國香蕉品種多為巴西蕉，受FOC 4威脅最大，因此防治香蕉枯萎病迫在眉睫。據(jù)報道，目前對該病防治的主要途徑包括輪作、選用抗病品種［5］、化學防治［6］及生物防治等。目前推廣的抗病品種屬中抗品種，并不能完全控制枯萎病的發(fā)生，且農(nóng)藝性狀不佳，品質(zhì)較差，如臺灣1號、GCTCV-215等；使用化學藥劑，不僅會殺滅土壤中的有益菌類，且長期使用，對環(huán)境污染影響較大。因此生物防治被認為是目前最安全的防治措施，符合環(huán)境保護和有機食品發(fā)展要求。

香蕉枯萎病的生物防治已成為各國的研究熱點。紫黑鏈霉菌（Streptomyces violaceusniger）［7］、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）［8］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［9］被證明對FOC 4具有明顯的抑制作用，Perez-Vicente等［10］研究報道，抗病品種種植與生防菌的施用相結(jié)合，對香蕉枯萎病的防效達95％以上，說明生物防治香蕉枯萎病是完全可行的。本研究是采集香蕉植株根際土壤，分離并篩選出對FOC 4有明顯抑制作用的拮抗菌株，測定各拮抗菌株的發(fā)酵液對FOC 4菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用，篩選一株活性最強的拮抗菌株，旨在通過盆栽試驗研究其對香蕉枯萎病的防治效果，并通過形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征、細胞壁化學成分分析和16S rDNA 序列及其系統(tǒng)發(fā)育分析等研究對該菌株進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌 香蕉枯萎病病原菌（FOC 4）：尖孢鐮刀菌古巴?；? 號生理小種（Fusarium oxysporium f. sp. cubense 4，F(xiàn)OC4），由本實驗室保藏。

供試香蕉苗：巴西蕉，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院種苗組培中心提供。

1.1.2 樣品采集 供分離的土樣采自海南臨高美臺、南寶蕉園，去除大顆粒石塊和植物殘渣，備用。

1.1.3 主要培養(yǎng)基 分離放線菌采用高氏一號合成培養(yǎng)基，為抑制細菌與真菌的生長，倒平板前加入0.005％的無菌重鉻酸鉀。

FOC 4的培養(yǎng)及平板對峙試驗采用PDA培養(yǎng)基。

拮抗菌的發(fā)酵采用黃豆粉液體培養(yǎng)基（可溶性淀粉20g，酵母粉5g，氯化鈉4g，黃豆粉15g，蛋白胨2g，碳酸鈣4g，pH7.2-7.4，1×105Pa滅菌50min）。

放線菌的形態(tài)學觀察采用高氏一號瓊脂、酵母膏麥芽汁瓊脂、燕麥片瓊脂、無機鹽淀粉瓊脂、葡萄糖天冬素瓊脂、胨酵母膏鐵瓊脂、酪氨酸瓊脂等7種培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 放線菌的分離與篩選

1.2.1.1 土壤放線菌的分離 稱取土樣10g，加入90mL無菌水，于28℃、200r/min的搖床中充分震蕩30min，取其上清液用無菌水10倍逐級稀釋，依次稀釋成10-2、10-3和10-4濃度，各吸取100μL涂布于加重鉻酸鉀的高氏一號培養(yǎng)基平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，適時挑取不同形態(tài)的菌落進行劃線，純化后保存。

1.2.1.2 拮抗放線菌的篩選 采用平板對峙法，在無菌環(huán)境下，將培養(yǎng)5-6d的FOC 4（直徑為6mm）靶標菌接種至PDA平板中央，并在距離靶標菌邊緣2.5cm 處接種待測放線菌，以不接放線菌，只接FOC 4的PDA平板作為對照（CK），于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5d后，測量各抑菌帶的大小，初篩出對FOC 4有明顯拮抗效果的菌株，連續(xù)接種5代進行復篩，最終篩選出拮抗效果最好的菌株進行下一步試驗。

1.2.1.3 拮抗放線菌發(fā)酵液對FOC 4抑制作用的測定 拮抗菌發(fā)酵濾液的制備：拮抗菌接種于黃豆粉液體培養(yǎng)基中，28℃、200r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)7d，取發(fā)酵液8000r/min離心15min，上清液用微孔濾膜過濾除菌。

FOC 4孢子懸浮液的制備：將FOC 4接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，待菌絲鋪滿平板后，用無菌水配制成1×106cfu/mL孢子懸浮液。

拮抗放線菌發(fā)酵液對FOC 4菌絲生長的影響［11］：在熔融態(tài)的PDA培養(yǎng)基中加入拮抗菌發(fā)酵濾液，搖勻制成平板。將直徑為6mm的FOC 4靶標菌接種至平板中央，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5d后，觀察FOC 4菌絲的生長情況，并用顯微鏡觀察各處理的FOC 4菌絲形態(tài)變化，以純培養(yǎng)的FOC 4菌落邊緣菌絲為對照，每處理重復3次。

拮抗放線菌發(fā)酵液對FOC 4孢子萌發(fā)的影響：將拮抗菌發(fā)酵濾液與FOC 4孢子懸浮液等體積混合均勻并置于玻片上，于溫度為28℃，濕度為80％的人工氣候箱中光照培養(yǎng)24h，每一處理設5個重復。取出玻片在顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)情況（以孢子萌發(fā)的芽管長度達到或超過孢子直徑長度的一半定為萌發(fā)）［12］，并計算各處理的孢子萌發(fā)率，以無菌水處理為對照（CK），以5次重復的平均值作為測定結(jié)果。

孢子萌發(fā)抑制率（％）=［（對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對照孢子萌發(fā)率］×100％

1.2.2 拮抗放線菌1-g-59對香蕉枯萎病的盆栽效果測定 試驗設3個處理：①處理1，清水；②處理2，接種病原菌+拮抗放線菌1-g-59發(fā)酵液；③處理3，接種病原菌。每處理15株香蕉苗，重復3次。

拮抗菌發(fā)酵液與病原菌孢子懸浮液的制備方法同1.2.1.3。

采用蘸根浸菌法接種［13］：用針刺傷香蕉組培苗的根尖，再將根浸沒于1×106cfu/mL的孢子懸浮液中，30min后移栽于盆缽中，并將剩余的病原菌孢子懸浮液澆入栽有香蕉幼苗的土壤中，接種后置于室溫、自然光照條件下培養(yǎng)，常規(guī)的水肥管理。接種病原菌10d后，處理2施用拮抗菌發(fā)酵液，每株灌注100mL。

病情分級：0級為無癥狀；1級為整株無變黃葉片；2級為1-2片葉萎蔫；3級為全株1/3-1/2葉片萎蔫；4級為全株1/2-3/4葉片萎蔫；5級為全株3/4以上葉片萎蔫或死亡。

DSI=∑（病害的級別×該級別的植株數(shù)）/供試植株數(shù)

相對防治效果（％）=［（對照病情指數(shù)－ 處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)］×100％

1.2.3 拮抗菌株的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)特征 采用平皿插片法［14］，將菌株1-g-59接種于高氏一號固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)14d，取插片用臺式掃描電鏡進行菌株形態(tài)觀察。

1.2.3.2 培養(yǎng)特征 參照《放線菌的分類和鑒定》［15］和《鏈霉菌鑒定手冊》［16］中的方法。將菌株1-g-59和Streptomyces lunalinharesiiRCQ1071T分別接種于高氏一號瓊脂、酵母膏麥芽汁瓊脂、燕麥片瓊脂、無機鹽淀粉瓊脂、葡萄糖天冬素瓊脂、胨酵母膏鐵瓊脂、酪氨酸瓊脂等7種培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)7-10d，觀察菌絲體的顏色及可溶性色素情況。

1.2.3.3 細胞壁化學成分分析 采用Hasegawa等［17］薄板層析法對菌株1-g-59進行全細胞水解液的氨基酸和糖型分析。

1.2.3.4 生理生化特征 參照《放線菌的分類和鑒定》和《鏈霉菌鑒定手冊》中的方法觀察菌株1-g-59和Streptomyces lunalinharesiiRCQ1071T的生理生化特性，進行明膠液化、鼠李糖、L-酪氨酸、木糖、棉子糖、L-阿拉伯糖、精氨酸、蛋氨酸、淀粉酶水解、脲酶、H2S的產(chǎn)生等方面的檢測。

1.2.3.5 16S rDNA 序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育分析 基因組DNA提取參照姜淑梅［18］的方法。根據(jù)放線菌16S rDNA 的結(jié)構(gòu)特點，PCR 擴增選用通用引物27F ：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R ：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。反應體系 50μL ：1μL 模板、1μL 引物 1492R 、1μL 引物 27F、25μL PCR mastermix、22μL ddH2O）。PCR 擴增程序 ：94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，35個循環(huán)；72℃終延伸10min，4℃保存。取50μL PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在紫外燈下觀察、并拍照保存。

電泳完成后的凝膠，經(jīng)拍照保存后，對大小約為1500bp的條帶進行切膠回收?；厥掌窝b入2mL無菌離心管中，用愛思進生物技術(shù)有限公司提供的AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒進行回收得到DNA?；厥盏玫降腄NA用寶生物工程有限公司提供的pMD18-T Vector 進行克隆。將樣品送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。

經(jīng)測序獲得拮抗放線菌1-g-59的16S rDNA序列，將該序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行比對分析（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），采用BioEdit、Mega5.0等軟件對菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法（Neighbour-joining，NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 放線菌的分離與篩選

共分離出117株放線菌，采用平板對峙法進行復篩，最終篩選出對FOC 4拮抗效果較強的5株放線菌（表1）。

表1 五株放線菌的拮抗效果

2.2 5株拮抗放線菌發(fā)酵液對FOC 4抑制作用的測定

2.2.1 對FOC 4菌絲生長的影響 觀察培養(yǎng)5d的FOC 4菌絲，發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同拮抗菌發(fā)酵濾液處理，F(xiàn)OC 4菌絲生長均受到不同程度的抑制，F(xiàn)OC 4直徑均＜1.0cm，混-g2-65B發(fā)酵濾液使FOC 4菌絲變?yōu)樽仙?-M-03B發(fā)酵濾液使帶靶標菌的培養(yǎng)基塊變黑，而1-g-59發(fā)酵液處理的FOC 4菌絲幾乎消失，靶標菌的培養(yǎng)基塊變?yōu)楹谏?，且培養(yǎng)基塊底部有淺黃色黏性分泌物產(chǎn)生。此外，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)1-g-59發(fā)酵液處理的FOC 4菌絲體畸形、分枝增多、菌絲破裂、消解；而對照FOC 4菌絲細長、光滑、均勻。

2.2.2 對FOC 4孢子萌發(fā)抑制作用的測定 結(jié)果表明，對照組（CK）的FOC 4孢子萌發(fā)率達92％，經(jīng)拮抗菌發(fā)酵液處理的FOC 4孢子萌發(fā)均受到不同程度的抑制，混-g2-25A發(fā)酵液處理的FOC 4孢子萌發(fā)率達88％，抑制率為4.3％；混-g2-65、3-M-03B、混-g2-65B這3株拮抗菌發(fā)酵液處理的FOC 4孢子萌發(fā)率均小于6.25％，抑制率均大于93.2％；而1-g-59發(fā)酵液處理的FOC 4孢子萌發(fā)率為0，抑制率達100％。圖1為對照組（CK）和1-g-59發(fā)酵液處理的FOC 4孢子萌發(fā)情況。

圖1 1-g-59發(fā)酵液對FOC 4孢子萌發(fā)的影響

2.2.3 拮抗放線菌1-g-59發(fā)酵液對香蕉枯萎病的盆栽效果測定 移栽14d后，處理3（只接種病原菌）的植株出現(xiàn)黃葉，28d后處理3的植株出現(xiàn)假莖開裂，45d后處理3的蕉苗發(fā)病嚴重，有的植株枯死，病情指數(shù)為4.24；處理1（清水）的植株均健康生長；處理2（病原菌+發(fā)酵液）病情指數(shù)為1.49，防治效果為64.9％（表2）。結(jié)果表明，拮抗放線菌1-g-59發(fā)酵液對香蕉枯萎病有一定的防治效果。

表2 1-g-59發(fā)酵液對香蕉枯萎病的盆栽防治效果

2.2.4 拮抗放線菌1-g-59的分類鑒定

2.2.4.1 形態(tài)學特征 菌株1-g-59在高氏一號培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d后菌落呈灰白色，單菌落成不規(guī)則的圓形，表面干燥、有皺紋?；鶅?nèi)菌絲黃褐色，氣生菌絲灰白色，無可溶性色素。通過臺式掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)該菌株氣生菌絲發(fā)達，非輪生，孢子成直或柔曲的鏈，氣生菌絲形成孢子鏈，孢子為圓柱狀（圖2）。

圖2 菌株1-g-59的孢子鏈照片（6400×）

2.2.4.2 培養(yǎng)特征 由表3可以看出，菌株1-g-59在7種培養(yǎng)基中均能生長，但在無機鹽淀粉瓊脂和甘油天門冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基上生長得慢，產(chǎn)孢較少；在不同培養(yǎng)基上，基內(nèi)菌絲顏色有黃褐色、灰黃色、灰色；氣生菌絲有灰色、灰白色、白色；在7種培養(yǎng)基中均不產(chǎn)生可溶性色素。

表3 菌株1-g-59在不同培養(yǎng)基上的生長特征

2.2.4.3 細胞壁化學成分 菌株1-g-59全細胞水解液中含有L，L-DAP和甘氨酸，細胞壁屬于I型，無特征性糖，糖型C，進一步驗證菌株1-g-59為鏈霉菌屬。

2.2.4.4 生理生化特征 由表4可以看出，菌株1-g-59能利用L-酪氨酸木糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、精氨酸、蛋氨酸；不能利用棉子糖；水解淀粉能力弱；明膠液化。菌株1-g-59與Streptomyces lunalinharesii的生理生化特征基本相同。

表4 菌株與Streptomyces lunalinharesii表型特征的比較

2.2.4.5 16S rDNA序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育分析 將菌株1-g-59的16S rDNA進行PCR擴增得到一條1500bp左右的條帶，經(jīng)序列測定，其大小為1576bp。將其DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中相應的DNA序列進行BLAST相似性分析，結(jié)果表明，與菌株1-g-59的16S rDNA同源性較高的均為鏈霉菌，其中與之同源性最高的是Streptomyces lunalinharesiiRCQ1071T，相似性達99.26％。根據(jù)序列同源性從高到低的原則，挑取11株菌株的16S rDNA序列，運用BionEdit、Mega5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），菌株 1-g-59與Streptomyces lunalinharesiiRCQ1071T處于同一分支，親緣關(guān)系最近。

圖3 依據(jù)16S rDNA 序列構(gòu)建菌株1-g-59與鏈霉菌屬相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

近年來土傳病害的防治研究在中國發(fā)展很快，尤其是在水稻、小麥和油菜方面，已有防治稻瘟病、紋枯病、菌核病等病害的生物農(nóng)藥相繼問世［19］。但香蕉枯萎病的生物防治研究起步較晚，目前還沒有成功的商業(yè)化產(chǎn)品。本研究從蕉園的根際土壤中分離出117株放線菌，通過篩選獲得5株對FOC 4具有較強拮抗效果的放線菌，其中菌株1-g-59的拮抗效果最強，對FOC 4的菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用最大，其發(fā)酵液處理的靶標菌培養(yǎng)基塊底部有淺黃色黏性分泌物產(chǎn)生，這有可能是拮抗菌發(fā)酵液產(chǎn)生的具有抑制FOC 4菌絲生長的分泌物，其成分有待進一步研究。菌株1-g-59發(fā)酵液能使FOC 4菌絲體畸形、分枝增多、菌絲破裂、消解，還能有效地抑制FOC 4孢子萌發(fā)，這與文獻報道［20，21］生防菌的作用機制一致；且其發(fā)酵液對香蕉枯萎病的盆栽防治效果達64.9％，說明該菌株可能產(chǎn)生對FOC4有拮抗效果的活性物質(zhì)，具有較好的開發(fā)價值。

菌株1-g-59具有典型的鏈霉菌特征，16S rDNA序列分析表明菌株1-g-59與Streptomyces lunalinharesiiRCQ1071T序列相似性達99.26％，在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支，親緣關(guān)系最近，且經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)二者的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征基本相同［22］，因此鑒定菌株1-g-59為Streptomyces lunalinharesii。

本研究為該菌株今后的應用、香蕉枯萎病的生防菌制劑的開發(fā)奠定了基礎，該菌株的抑菌活性成分以及其抑菌機理還有待進一步的深入研究。

4 結(jié)論

通過分離和篩選獲得5株對FOC 4具有拮抗作用的放線菌，其中以菌株1-g-59活性最強。菌株1-g-59發(fā)酵液能使FOC 4菌絲全部消失，且其對FOC 4孢子萌發(fā)的抑制率達100％。菌株1-g-59發(fā)酵液對香蕉枯萎病的盆栽防治效果達64.9％。鑒定菌株1-g-59為Streptomyces lunalinharesii。

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