化學(xué)誘導(dǎo)后白木香轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的構(gòu)建與測(cè)序

吳宏清 王磊 陶美華 高曉霞 白玲 章衛(wèi)民

白木香［Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg］又稱(chēng)土沉香，瑞香科沉香屬植物，是國(guó)產(chǎn)沉香的唯一植物資源［1］。當(dāng)白木香樹(shù)干受到物理、化學(xué)傷害或真菌侵染的情況下，可分泌出一種氣味芬芳的防御性黑色樹(shù)脂，即為我國(guó)傳統(tǒng)名貴藥材沉香。在自然界，沉香的形成需要幾年至十幾年、甚至數(shù)十年的時(shí)間。為了快速獲得珍貴的沉香藥材，人們通過(guò)各種方法人工造香。布蘭切特和范貝克［2］利用亞硫酸氫鈉、氯化鈉、甲酸等化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)沉香屬（Aquilaria spp.）植物產(chǎn)生沉香；Chen等［3］用氯化鈉誘導(dǎo)成年白木香產(chǎn)生的沉香與天然沉香的化學(xué)成分極為相似。倍半萜類(lèi)化合物是沉香的主要藥效成分［4］，Kumeta和 Ito［5］及 Okudera 和 Ito［6］的研究結(jié)果表明，水楊酸和茉莉酸甲酯能誘導(dǎo)沉香屬植物的懸浮細(xì)胞產(chǎn)生沉香倍半萜前體物質(zhì)α-愈創(chuàng)木烯（α-guaiene）、α-蛇麻烯（α-humulene）和 δ-愈創(chuàng)木烯（δ-guaiene）。Xu等［7］從傷害誘導(dǎo)的白木香細(xì)胞中成功克隆到主產(chǎn)物為δ-愈創(chuàng)木烯的合成酶基因，但是從前體物質(zhì)到沉香特征產(chǎn)物間的代謝途徑仍然未知。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是最近發(fā)展起來(lái)的利用深度測(cè)序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)［8］，目前已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和臨床研究及藥物研發(fā)等。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)合表達(dá)譜分析的方法，可以在沒(méi)有參考基因組的條件下對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全測(cè)序，以獲得的轉(zhuǎn)錄組信息為參考，對(duì)不同樣品的表達(dá)譜進(jìn)行基因注釋?zhuān)ㄟ^(guò)比較獲得不同表達(dá)譜間的差異表達(dá)基因，進(jìn)而研究其基因功能。因此，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序有助于白木香結(jié)香相關(guān)功能基因的發(fā)現(xiàn)，闡明沉香特征產(chǎn)物的代謝途徑，揭示人工誘導(dǎo)白木香結(jié)香的分子機(jī)制。

本研究對(duì)5年樹(shù)齡、化學(xué)誘導(dǎo)后1年的成年白木香植株進(jìn)行總RNA的提取，獲得的總RNA用于Illumina轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，經(jīng)測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建，上機(jī)測(cè)序，數(shù)據(jù)過(guò)濾，序列組裝，旨在獲得完整的白木香轉(zhuǎn)錄組信息，為后續(xù)的表達(dá)譜分析積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)樣品采自廣東省信宜市珍稀沉香發(fā)展有限公司的白木香基地，參考王磊等［9］進(jìn)行結(jié)香試驗(yàn)，其中用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的白木香樣品取自同一株5年樹(shù)齡、甲酸處理后1年的已結(jié)香的白木香植株及另外一株未進(jìn)行結(jié)香試驗(yàn)的白木香植株。樣品采集時(shí)利用前端成鉤狀的刨刀，除去樹(shù)皮后，在樹(shù)干上從外到內(nèi)依次刨下樣品，外圍未變色部分為白木樣品（W樣品），與白木相鄰的一圈深棕色木材為結(jié)香樣品（A樣品），白木樣品與結(jié)香樣品間還有部分顏色為淺棕色的木質(zhì)部，作為結(jié)香與未結(jié)香間的過(guò)渡樣品（T樣品），最內(nèi)側(cè)已腐爛的部分作為腐木樣品（D樣品），以及從另外一株未結(jié)香植株上采集的白木樣品（C樣品）。采集完樣品后立即用錫箔紙包裹置于液氮中保存。

1.1.2 主要儀器與試劑 BioSpec-nano生命科學(xué)紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)；EPS 601電泳儀；GE ImageQuant 350凝膠成像系統(tǒng)；Hettich VNIVERSAL-32R臺(tái)式冷凍離心機(jī)；Agilent 2100生物分析儀；Illumina HiSeqTM2000測(cè)序儀。焦碳酸二乙酯（DEPC）購(gòu)自廣州杰順生物科技有限公司；改良異硫氰酸胍-CTAB提取液（38％水飽和酚，1mol/L異硫氰酸胍，2％ CTAB，100mmol/L NaAc-HAc pH5.2，2mol/L NaCl，2％ PVP），用前混勻；抽提液Ⅰ（水飽和酚∶氯仿∶異戊醇 = 25∶24∶1）；抽提液Ⅱ（氯仿∶異戊醇 = 24∶1）。

1.2 方法

1.2.1 白木香總RNA的提取 采用改良異硫氰酸胍-CTAB法分別提取白木香W、A、T、D和C樣品總RNA：樣品用液氮研磨后迅速分裝到含有改良異硫氰酸胍-CTAB提取液的離心管中，劇烈震蕩，室溫靜置5min；等體積的抽提液I抽提2次，離心取上清；等體積的抽提液II抽提1次，離心取上清；加入1/2體積的無(wú)水乙醇以及與上清等體積的4mol/L LiCl，顛倒混勻，-30℃靜置過(guò)夜，離心取沉淀；沉淀溶于適量DEPC處理水中，加入1/10體積3mol/L NaAc-HAc，混勻后，加入3倍體積無(wú)水乙醇，-30℃靜置30min，4℃離心10min；75％乙醇洗滌沉淀2次，溶于30μL DEPC處理水中低溫保存。Agilent 2100生物分析儀對(duì)總RNA的RIN值及28S∶18S比值進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證RNA的完整性。等量合并各樣品總RNA進(jìn)入下一步操作。

1.2.2 白木香轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建 用帶有Oligo（dT）的磁珠富集總RNA樣品中的mRNA，加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第一條cDNA鏈。加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，然后用QiaQuick PCR純化試劑盒純化產(chǎn)物，用EB緩沖液洗脫后做末端修復(fù)、加A并連接測(cè)序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的測(cè)序文庫(kù)用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 Illumina HiSeqTM2000上機(jī)測(cè)序［11］使用 Illumina HiSeqTM2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的測(cè)序。樣品為白木香W、A、T、D和C各樣品合并后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)。測(cè)序得到的原始圖像經(jīng)base calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)Raw reads。

1.2.4 數(shù)據(jù)過(guò)濾 對(duì)測(cè)序所得的Raw reads進(jìn)行過(guò)濾，濾去的數(shù)據(jù)包括含接頭的reads，N的比例大于5％的reads，重復(fù)的和質(zhì)量數(shù)較低的reads（質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整個(gè)read的20％以上），過(guò)濾后所得為Clean reads，后續(xù)分析都基于此Clean reads。

1.2.5 序列的 De novo 組裝［12］使用 Trinity［10］軟件對(duì)Clean reads做De novo組裝。將具有一定長(zhǎng)度overlap的reads連成更長(zhǎng)的片段Contig，然后與Clean reads重新比對(duì)，通過(guò)paired-end reads確定Contig所屬的轉(zhuǎn)錄本以及在轉(zhuǎn)錄本中的分布，Trinity軟件能將這些Contig連在一起，得到兩端不能再延長(zhǎng)的序列。然后使用Tgicl對(duì)其進(jìn)行去冗余和進(jìn)一步拼接，并對(duì)其進(jìn)行同源轉(zhuǎn)錄本聚類(lèi)，得到最終的Unigene。聚類(lèi)后Unigene分為兩部分，一部分是clusters（以CL開(kāi)頭），另一部分是singletons（以Unigene開(kāi)頭）。

2 結(jié)果

2.1 白木香總RNA的獲得

使用改良異硫氰酸胍-CTAB法提取白木香各組織總RNA，經(jīng)Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)，RIN值最小為6.7，28S∶18S均大于1.0，RNA總量遠(yuǎn)大于20μg，滿足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的需求，結(jié)果如表1所示。

表1 用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的白木香總RNA質(zhì)量

2.2 測(cè)序產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)

如表2所示，Illumina HiSeqTM2000上機(jī)測(cè)序后獲得Raw reads共58804828條，過(guò)濾后獲得Clean reads共54685634條，總測(cè)序長(zhǎng)度為4921707060nt，Q20值達(dá)97.45％，測(cè)序質(zhì)量較高。

2.3 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)及質(zhì)量評(píng)估

如表3所示，經(jīng)初步組裝后，共獲得190109條Contigs，平均長(zhǎng)度有324nt，N50值為549，進(jìn)一步組裝后，共獲得83467條Unigenes，平均長(zhǎng)度高達(dá)702nt，N50值較高，達(dá)1120，序列組裝理想，使得白木香的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到較好的保存。

表2 白木香轉(zhuǎn)錄組測(cè)序統(tǒng)計(jì)

表3 組裝結(jié)果

圖1為所獲得Contigs的組裝統(tǒng)計(jì)結(jié)果。序列長(zhǎng)度大于等于500nt的Contigs高達(dá)26786條，占總Contigs的14.09％；其中，大于等于1000nt的Contigs達(dá)2518條，占總Contigs的1.32％；大于等于2000nt的Contigs達(dá)1429條，占總Contigs的0.75％；大于等于3000nt的Contigs有1012條，占總Contigs的0.53％。

圖2表示Contigs進(jìn)一步組裝后獲得Unigenes的組裝統(tǒng)計(jì)結(jié)果。序列長(zhǎng)度大于等于1000nt的Unigenes高達(dá)17155條，占總Unigenes的20.56％；其中，大于等于2000nt的Unigenes有5189條，占總Unigenes的6.22％；大于等于3000nt的Unigenes有1691條，占總Unigenes的2.03％。

3 討論

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是建立在新一代高通量測(cè)序平臺(tái)（如Roche GS FLX或Illumina HiseqTM2000）上的cDNA測(cè)序技術(shù)，自2008年Nature和Science上分別發(fā)表利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）轉(zhuǎn)錄組的論文［13，14］后，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已成為研究轉(zhuǎn)錄組的革命性工具。對(duì)比轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的其他方法，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可檢測(cè)任意物種的轉(zhuǎn)錄組，無(wú)需前提信息，無(wú)需克隆，理論上可檢測(cè)所有轉(zhuǎn)錄信息。

圖1 白木香轉(zhuǎn)錄組Contigs組裝統(tǒng)計(jì)

圖2 白木香轉(zhuǎn)錄組Unigenes組裝統(tǒng)計(jì)

為了研究白木香未結(jié)香組織和結(jié)香組織間的表達(dá)差異，獲得與結(jié)香相關(guān)的功能基因，可以采用數(shù)字基因表達(dá)譜分析的方法，篩選未結(jié)香與結(jié)香組織間的差異表達(dá)基因。然而，如今NCBI上未有白木香的參考基因組或參考轉(zhuǎn)錄組信息，因此必須先進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得總的轉(zhuǎn)錄組信息，在獲得轉(zhuǎn)錄組序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行表達(dá)譜分析及差異基因的研究。

張爭(zhēng)等［15］利用454測(cè)序平臺(tái)，對(duì)機(jī)械傷害后的白木香莖的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，共獲得22095條平均長(zhǎng)度為314nt的Unigenes。本研究對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)后白木香樣品的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、組裝，共獲得83467條平均長(zhǎng)度為702nt的Unigenes，轉(zhuǎn)錄組信息保存較完整，為化學(xué)誘導(dǎo)白木香結(jié)香機(jī)理的研究提供大量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。為了便于后續(xù)的表達(dá)譜分析，防止因個(gè)體差異引起的無(wú)關(guān)信息過(guò)多，本研究選擇來(lái)自同一株白木香不同部位的W、T、A和D 4個(gè)樣品用于后續(xù)的分析，可消除因來(lái)自不同植株的樣品對(duì)差異基因篩選的干擾。將W樣品作為對(duì)照組，T、A和D 3個(gè)樣品分別作為試驗(yàn)組，獲取各對(duì)照的差異表達(dá)基因，研究其基因功能，進(jìn)而揭示化學(xué)誘導(dǎo)白木香結(jié)香的分子機(jī)理，獲得與化學(xué)誘導(dǎo)相關(guān)的基因和轉(zhuǎn)錄因子。

4 結(jié)論

采用改良異硫氰酸胍-CTAB法提取白木香各組織總RNA，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)后進(jìn)行Illumina HiSeqTM2000上機(jī)測(cè)序，共獲得54685634條Clean reads，總長(zhǎng)度為4921707060nt，經(jīng)多次組裝獲得83467條Unigenes，平均長(zhǎng)度為702nt，N50值為1120，大于等于3000nt的Unigenes有1691條，占總Unigenes的2.03％，測(cè)序和組裝質(zhì)量較高。

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