沙利度胺抑制小鼠T淋巴瘤的實驗研究

吳廣銀 張 辰 王莉莉 姚志華 張明智

1.河南省人民醫(yī)院腫瘤放療科，河南鄭州 450003；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南鄭州 450052；3.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 河南省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南鄭州 450003

惡性淋巴瘤在我國雖然發(fā)病率不高，但惡性程度高，預(yù)后較差，特別是T細胞淋巴瘤經(jīng)綜合治療5年生存率僅為30%[1]。沙利度胺（反應(yīng)停，酞咪哌啶酮，Thalidomide）因?qū)е绿夯斡?0世紀60年代被禁用。1994年以來研究發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)機體免疫，抑制腫瘤血管生成等作用而用于多種腫瘤的治療[2]。本文觀察了沙利度胺對小鼠移植性T淋巴瘤的抑制作用，為其更好地應(yīng)用于臨床提供一定的實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 細胞株及實驗動物

BALB/C 純系雌性小鼠，體重 18～22 g，6～8 周齡，購于河南省實驗動物中心。EL-4細胞（鼠T淋巴瘤白血病細胞株）購自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所細胞庫。

1.2 藥品、試劑、儀器

沙利度胺由常州制藥廠生產(chǎn)，批號：0508241。原位細胞凋亡檢測試劑盒（POD），購自華美生物工程公司。TNF-α引物由上海生工生物有限公司合成，上游引物序列：5'-AGT CCG GGC AGG TCT ACT TT-3'， 下游引物：5'-GCA CCT CAG GGA AGA GTC TG-3'，擴增產(chǎn)物為422 bp。β-actin上游引物序列：5'-CCA GAG CAA GAG AGG TAT CC-3'，下游引物序列：5'-GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA-3'，擴增產(chǎn)物為276 bp。Trizol購于invitrogen公司，rTag酶購于TaKaRa公司。

2 方法

2.1 模型的建立

EL-4細胞懸浮生長于含15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液置培養(yǎng)箱。培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2。選生長對數(shù)期細胞用于實驗，無菌生理鹽水調(diào)細胞濃度為5×106個/mL。取懸液0.2 mL接種于32只BALB/C小鼠右腋部皮下。

2.2 抑瘤率實驗

接種后第2天，將32只小鼠隨機分為4組，每組8只。①陰性對照組：小鼠 8只，生理鹽水灌胃 25 mL/（kg·d）共14 d；②低劑量組：小鼠 8 只，沙利度胺灌胃 50 mg/（kg·d）共14 d；③中劑量組：小鼠 8 只，沙利度胺灌胃 200 mg/（kg·d）共 14 d；④高劑量組：小鼠 8 只，沙利度胺灌胃 400 mg/（kg·d）共14 d。觀察小鼠體重，并用游標(biāo)卡尺測腫瘤直徑，計算腫瘤體積。于用藥后第15天處死小鼠，分離腫瘤，計算抑瘤率。第2批32只小鼠同樣方法建立模型分組記錄平均生存期。公式：瘤體積=ab2/2（a為腫瘤最長徑，b為腫瘤最短徑）；抑瘤率=（對照組瘤重-給藥組瘤重）/對照組瘤重×100%。

2.3 HE染色

將石蠟切片，常規(guī)脫蠟、乙醇梯度脫水，蘇木素-伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

2.4 TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡

取腫瘤組織，10%福爾馬林固定24 h，脫水包埋，4 μm連續(xù)切片，按試劑盒說明操作。顯微鏡下觀察：以細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性細胞，計算凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）：凋亡細胞占全部腫瘤細胞的比例，在高倍鏡下計數(shù)每100個腫瘤細胞中的陽性細胞數(shù)，每例至少計數(shù)1000個腫瘤細胞，取其平均數(shù)。

2.5 RT-PCR法檢測TNF-α mRNA的表達

2.5.1 常規(guī)提取腫瘤組織RNA用TaKaRa公司cDNA第一鏈合成試劑盒（First Strand cDNA synthesis kit）合成cDNA第一鏈，參照說明書操作。

2.5.2 25μL PCR 擴增體系 DDH2O 14.5μL，10×PCR buffer 2.5 μL，β-actin上、下游引物各1μL，TNF-α上、下游引物各1μL，cDNA 1μL，dNTP 2μL，Taq 酶1μL。

2.5.3 PCR擴增條件 預(yù)變性：94℃ 2 min，變性：94℃ 30 s，退火溫度 55.6℃，退火時間 30 s，72℃延伸 1 min，進行 30個循環(huán)后，再72℃繼續(xù)延伸5 min，置4℃保存。

2.5.4 電泳 1%瓊脂糖電泳，5 V/cm，電泳時間20 min，觀察PCR產(chǎn)物，照像，計算機系統(tǒng)分析光密度，計算表達量。公式：TNF-α mRNA相對表達量=擴增產(chǎn)物的光密度值TNF-α/擴增產(chǎn)物光密度值β-actin×100%。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組之間用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 沙利度胺對荷瘤小鼠的抑瘤作用

沙利度胺各組瘤重與對照組相比減小，低、中、高劑量組抑瘤率分別為：17.75%，36.73%，42.04%。各組平均生存期較陰性對照組延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。各組比較，低劑量組與中高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），中高劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表1。

表1 沙利度胺對荷瘤小鼠的抑瘤作用（±s）

表1 沙利度胺對荷瘤小鼠的抑瘤作用（±s）

注：與給藥前體重比較，aP<0.05；與陰性對照組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05

陰性對照組低劑量組中劑量組高劑量組22.5±2.6 27.8±4.2*29.7±3.7*▲25.9±3.8*▲20.66±2.03 21.08±1.33 20.90±0.84 20.68±2.14 22.43±1.96a 22.76±1.85a 22.19±2.02a 21.31±1.66 0.5426±0.1801 0.4482±0.1278 0.3462±0.1587 0.3021±0.1749 0.00 17.75*36.73*▲42.04*▲組別 生存期（d）瘤重（g）抑瘤率（%）體重（g）給藥前 給藥后

3.2 HE染色結(jié)果

鏡下見組織異形性明顯，可見核分裂相，判斷為惡性腫瘤組織，腫瘤細胞呈彌漫性生長。沙利度胺各組腫瘤組織有不同程度的壞死，腫瘤細胞稀疏，大小不一。以中劑量為例，見圖1。

圖1 鼠EL-4移植瘤腫瘤組織（HE染色，400×）

3.3 TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡結(jié)果

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒可將處于不同階段的凋亡細胞DAB顯色后顯示出來，本實驗中沙利度胺各組小鼠腫瘤組織中散在分布著孤立的細胞核黃染或有棕黃色顆粒的細胞即凋亡細胞，其中，中高劑量組AI明顯高于陰性對照組（P<0.05）（圖2、表2）。

表2 中高劑量組凋亡指數(shù)結(jié)果（±s）

表2 中高劑量組凋亡指數(shù)結(jié)果（±s）

注：與陰性對照組比較，*P<0.05

陰性對照組中劑量組高劑量組2.31±0.94 9.23±1.56*10.86±1.73*組別 凋亡指數(shù)

3.4 RT-PCR法檢測TNF-α mRNA結(jié)果

以β-actin做內(nèi)參照，圖像分析得出各組移植瘤組織中TNF-α mRNA相對表達量，可見沙利度胺各劑量組腫瘤組織中TNF-α mRNA表達水平低于陰性對照組腫瘤組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3、表3。

4 討論

圖2 TUNEL法檢測小鼠腫瘤組織凋亡（SP，400×）

表3 各組TNF-α mRNA表達結(jié)果（±s）

表3 各組TNF-α mRNA表達結(jié)果（±s）

注：與陰性對照組比較，*P<0.05

陰性對照組低劑量組中劑量組高劑量組8888 0.871±0.194 0.732±0.113*0.523±0.056*0.474±0.173*組別 只數(shù) TNF-α mRNA表達

圖3 各組小鼠腫瘤組織TNF-α mRNA表達

沙利度胺是一個谷氨酸衍生物，化學(xué)名稱是N-（2，6二氧-3-哌啶基）-鄰苯二甲酰亞胺。目前臨床用于治療多發(fā)性骨髓瘤，腎癌等取得一定療效[3]，但有關(guān)治療淋巴瘤報道較少。本實驗中荷瘤鼠口服沙利度胺50～400 mg/kg，移植瘤體積縮小，抑瘤率分別是17.75%，36.73%，42.04%，各組小鼠生存時間明顯延長，較對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。即提示沙利度胺有直接抑制T細胞淋巴瘤的作用，與Beckers等[4]報道一致。

目前認為，腫瘤的發(fā)病與細胞凋亡的失衡直接相關(guān)。孫萍等[5]報道沙利度胺有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。本實驗中TUNEL法檢測腫瘤凋亡，鏡下觀察，治療組可見腫瘤細胞凋亡，形成凋亡小體，凋亡小體被周圍吞噬細胞吞噬、降解。腫瘤組織有輕度白胞浸潤和局灶性壞死。中高劑量組癌細胞AI明顯高于對照組，提示沙利度胺通過誘導(dǎo)T淋巴瘤細胞凋亡起到抑制腫瘤生長的作用。

TNF-α具有介導(dǎo)炎癥和免疫調(diào)節(jié)作用，其效應(yīng)包括激活淋巴細胞、釋放其他細胞因子（如IL-1、IL-6）、前列腺素和金屬蛋白酶；也可以促進血管形成和調(diào)節(jié)黏附分子作用。Majumder等[6]報道沙利度胺可以通過下調(diào)TNF-α的表達，從而抑制下游因子分泌，起到抑制腫瘤的作用。本實驗中RT-PCR法檢測移植瘤組織的TNF-α mRNA表達，發(fā)現(xiàn)沙利度胺處理組腫瘤組織TNF-α mRNA表達下降，較對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示沙利度胺抑制T細胞淋巴瘤的機制之一是降低TNF-α的表達。

總之，文獻報道[7-8]沙利度胺抗腫瘤機制復(fù)雜，可能與抑制微血管的生成，減少TNF-α的合成，降低IL-6的產(chǎn)生，抑制整合素的表達等有關(guān)。近年來，沙利度胺在臨床研究中取得了更肯定的療效：顧愛琴等[9]報道，沙利度胺聯(lián)合NP方案化療治療晚期非小細胞肺癌可以提高化療療效，延長中位生存期，減輕化療引起的嘔吐反應(yīng)。劉金等[10]研究發(fā)現(xiàn)沙利度胺聯(lián)合同步放化療治療小細胞肺癌有增加放療敏感性，提高局部控制率的作用。因此，對其衍生物——來那度胺的研究也成為熱點。Zinzani等[11]報道來那度胺聯(lián)合利妥昔單抗治療復(fù)發(fā)性彌漫大B細胞淋巴瘤可以提高療效。Zabransky等[12]的研究表明來那度胺對前列腺癌的治療有確切療效。在多發(fā)性骨髓瘤等血液病的研究中，Mc-Carthy等[13]報道來那度胺對骨髓移植后的患者維持治療，可以降低復(fù)發(fā)，延長生存期。

本實驗結(jié)果表明，沙利度胺可能通過誘導(dǎo)T淋巴瘤細胞的凋亡、抑制TNF-α的表達而發(fā)揮雙重抗腫瘤生長的作用，沙利度胺及其衍生物因其價格低廉，服用方便，副反應(yīng)少，有望成為治療淋巴瘤的有效藥物，但尚需要臨床進一步研究證實。

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