神經營養(yǎng)因子3基因轉染的施萬細胞在脊髓損傷大鼠中的實驗研究

趙紅星 馬世江 董玉珍▲

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院骨外科，河南衛(wèi)輝 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院神經內一科，河南新鄉(xiāng) 453000

脊髓損傷是臨床重癥，其對患者造成的損傷極為嚴重，可導致患者出現癱瘓等情況，極大地影響到患者的綜合生存狀態(tài)。近些年來較多研究顯示，施萬細胞移植對于脊髓損傷的治療效果較佳，但是其也存在一定的不足，如作用不夠持久、穩(wěn)定等，因此對其進行進一步地改善極為重要[1]。神經營養(yǎng)因子3是國內外較受認可的一類對神經損傷修復營養(yǎng)效果較佳的營養(yǎng)物質，但是其效果還有進一步的提升空間。近些年來出現了一些關于神經營養(yǎng)因子3基因轉染的施萬細胞研究，認為其有效彌補了單用兩者的不足，但也有一些研究認為其效果并不突出，應用價值不足。因此，對神經營養(yǎng)因子3基因轉染的施萬細胞進行研究的空間較大。本研究觀察了神經營養(yǎng)因子3基因轉染的施萬細胞在脊髓損傷大鼠中的作用，現將結果總結分析并報道如下：

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取90只健康Wistar大鼠為研究對象，所有大鼠均購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。將90只大鼠隨機分為A組（空白對照組）、B組（神經干細胞移植組）和C組（神經干細胞聯(lián)合神經營養(yǎng)因子3基因轉染的施萬細胞移植組）。A組30只大鼠中，雌雄各半，體重190～212 g，平均（204.1±6.3）g。 B 組 30 只大鼠中，雌雄各半，體重 188～214 g，平均（204.6±6.2）g。C 組 30 只大鼠中，雌雄各半，體重 191～210 g，平均（204.4±6.5）g。三組大鼠性別及體重差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 三組大鼠均采用Allen打擊法制作脊髓損傷模型。大鼠采用腹腔注射方式麻醉，于其胸12部位進行皮膚與肌肉的切開處理，置于俯臥位，采用打擊架進行打擊處理，打擊物重量為10.0 g，打擊的高度為50.0 mm左右，每只大鼠均連續(xù)打擊6次，至大鼠出現甩尾后模型制作完成。清洗切開的皮膚與肌肉，縫合處理，常規(guī)喂養(yǎng)，備用。

1.2.2 處理方法 A組為空白對照組，僅以10 μL培養(yǎng)液注入損傷部位，入針后分別從其損傷部位的頭、尾部以斜45°角注入。B組進行神經干細胞移植，顯露硬膜后，以單細胞注射器刺入損傷部位，將神經干細胞大約10 μL分別從損傷部位的頭部與尾部注入，然后觀察情況無異常后進行縫合。C組的處理方法與B組一致，但移植物為10 μL神經干細胞聯(lián)合神經營養(yǎng)因子3基因轉染的施萬細胞。三組大鼠均注射治療1次，并注意對損傷部位的保護。分別于移植前、移植后1、3個月每組取10只大鼠進行BBB評分、皮質誘發(fā)電位及神經功能相關指標的檢測、評估及比較。

1.2.3 檢測方法 皮質誘發(fā)電位的檢測指標為皮質誘發(fā)體感和運動電位，均采用丹麥產2000M型雙信道神經肌電描記儀進行檢測，其中，檢測過程中的刺激頻率為10次/s，而時限與分析時間分別為100 μs與10 ms，注意避免可能引起測量誤差的相關因素。神經功能相關指標檢測項目為脊髓組織微管相關蛋白 2（MAP-2）、神經生長因子（NGF）及腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF），取處死大鼠的脊髓組織，并以甲醛固定，進行相應的脫水及石蠟包埋處理，再將其以5 μm的規(guī)格切片，以免疫組化法進行處理及檢測，并將標本置于高倍鏡下閱片，進行陽性細胞數統(tǒng)計。由資深工作人員進行標本制作及閱片，每只大鼠制作4份切片，對其讀數，取平均值。

1.3 評價標準

采用BBB評分對移植干預前后大鼠進行后肢功能評估。BBB評分是評估大鼠脊髓損傷的重要量表，其分值范圍為0～21分，其中，0分表示可見到后肢運動，1～7分表示大鼠存在不同程度的后肢關節(jié)活動，活動的關節(jié)從少到多，由輕微活動到大幅度活動；8～16分表示大鼠后肢存在無、部分負重活動至持續(xù)負重行走，即表示爪面從輕微著地到可承重，承重重量從輕到重且可協(xié)調運動；17分及以上表示大鼠接近正?；顒又吝\動功能正常[2]，即從不穩(wěn)的協(xié)調運動到持續(xù)的協(xié)調運動，從而實現軀干的協(xié)調運動。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠移植前后BBB評分比較

移植前三組大鼠BBB評分中0～7分大鼠比例差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；而移植后1、3個月B組及C組0～7分大鼠比例均低于A組，C組0～7分大鼠比例低于B組，且C組移植后3個月0～7分大鼠比例明顯低于移植后1個月，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 三組大鼠移植前后BBB評分比較[n（%）]

2.2 三組大鼠移植前后皮質誘發(fā)電位比較

移植前三組大鼠皮質誘發(fā)體感和運動電位峰值比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；而移植后1、3個月B組及C組峰值均高于A組，C組峰值高于B組，且C組移植后3個月峰值明顯高于移植后1個月，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。 見表2。

2.3 三組大鼠移植前、移植后1、3個月神經功能相關指標比較

移植前三組大鼠的脊髓組織MAP-2、NGF及BDNF陽性細胞數比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；而移植后1、3個月B組及C組陽性細胞數均高于A組，C組陽性細胞數高于B組，且C組移植后3個月陽性細胞數明顯高于移植后1個月，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表3。

表2 三組大鼠移植前、移植后1、3個月皮質誘發(fā)電位比較（μV，±s）

表2 三組大鼠移植前、移植后1、3個月皮質誘發(fā)電位比較（μV，±s）

注：與A組同時間比較，*P＜0.05；與B組同時間比較，&P<0.05；與同組移植后1個月比較，#P＜0.05

A組移植前（n=10）移植后1個月（n=10）移植后3個月（n=10）B組移植前（n=10）移植后1個月（n=10）移植后3個月（n=10）C組移植前（n=10）移植后1個月（n=10）移植后3個月（n=10）51.17±6.26 53.86±6.75 56.96±7.35 51.20±6.21 201.37±23.06*227.63±26.48*51.16±6.31 241.36±27.34*&278.53±31.46*.53±3.46 32.64±4.07 34.15±4.12 30.58±3.43 150.23±22.67*193.57±27.18*30.60±3.42 186.72±26.83*242.57±30.56*#組別 皮質誘發(fā)體感電位 皮質誘發(fā)運動電位

表3 三組大鼠移植前后神經功能相關指標比較（個/HP，±s）

表3 三組大鼠移植前后神經功能相關指標比較（個/HP，±s）

注：與A組同時間比較，*P＜0.05；與B組同時間比較，&P<0.05；與同組移植后1個月比較，#P＜0.05；MAP-2：脊髓組織微管相關蛋白2；NGF：神經生長因子；BDNF：腦源性神經營養(yǎng)因子

A組移植前（n=10）移植后1個月（n=10）移植后3個月（n=10）B組移植前（n=10）移植后1個月（n=10）移植后3個月（n=10）C組移植前（n=10）移植后1個月（n=10）移植后3個月（n=10）8.12±2.35 9.20±2.56 10.07±2.71 8.15±2.31 14.87±2.82*19.35±2.97*8.17±2.34 20.86±2.93*&25.56±3.14*.15±0.86 5.73±0.95 6.16±1.03 4.17±0.82 9.15±1.23*11.72±1.36*4.20±0.83 12.62±1.48*&15.59±1.63*.24±0.93 6.39±1.14 7.13±1.21 5.27±0.90 13.07±1.85*16.83±2.12*5.22±0.95 17.56±2.20*&22.12±2.93*&#組別 MAP-2 NGF BDNF

3 討論

脊髓損傷為神經外科的危急癥之一，致殘率較高，且不易改善恢復，患者常常有截癱及四肢癱瘓等表現，嚴重影響患者的后期生存狀態(tài)。因此，改善患者的脊髓損傷狀態(tài)一直是臨床研究的熱點[3]。臨床中以往較多的實驗研究結果顯示[4-5]，神經干細胞及施萬細胞移植均是較佳的改善脊髓損傷的治療方法，效果較為突出，但是療效仍需改進、提升。施萬細胞移植治療的不足之處在于仍需進一步改進其脊髓神經的損傷修復作用，而NGF是近些年來應用于施萬細胞修飾的研究熱點，其中，神經營養(yǎng)因子3是研究較多的一類，其臨床作用尚可[6-7]，但對于其綜合優(yōu)勢的研究相對較少，也缺乏足夠的相關論證。對于神經損傷的修復及治療是一個緩慢的過程，需要治療干預方法具有長久且穩(wěn)定的效果。另外，對于脊髓損傷的治療效果要保證運動與感覺等綜合功能的改善，從而實現長久且全面發(fā)揮療效的作用。這些方面是近些年來臨床中對于干預效果有效程度評估的重要指標。

本文就神經營養(yǎng)因子3基因轉染的施萬細胞在脊髓損傷大鼠中的作用進行觀察，并將干預的效果與空白對照大鼠及采用神經干細胞移植的大鼠進行比較。結果顯示，神經營養(yǎng)因子3基因轉染的施萬細胞更有助于改善脊髓損傷大鼠的BBB評分、皮質誘發(fā)電位及神經功能相關指標，說明模型大鼠運動功能及神經功能均得到有效改善，從而肯定了神經營養(yǎng)因子3基因轉染的施萬細胞在脊髓損傷治療中的效果，且其改善作用呈現持續(xù)穩(wěn)定的狀態(tài)，即移植前至移植后1、3個月這種改善持續(xù)進行，從而肯定了神經營養(yǎng)因子3基因轉染的施萬細胞在作用持久方面的效果。分析原因認為可能與神經營養(yǎng)因子3更有效地促進了施萬細胞對于神經細胞的修復有關[8]。并且，神經營養(yǎng)因子3基因轉染的施萬細胞還具有有效控制神經元萎縮的功效，軸突再生得到有效促進[9-12]，故效果突出。另外，在神經受損后施萬細胞開始分化，并有選擇性地實現基因表達，從而為神經元的再生提供了必要前提，但這種效果不夠突出穩(wěn)定，需要進一步強化及穩(wěn)定，而神經營養(yǎng)因子3則可對這些不足進行有效的彌補，從而實現其穩(wěn)定且持久地發(fā)揮作用的目的。神經營養(yǎng)因子3還可以起到進一步增強神經元之間聯(lián)系的作用，可以改善神經損傷部位的微環(huán)境。

綜上所述，可以認為神經營養(yǎng)因子3基因轉染的施萬細胞既為神經損傷提供了必要的修復基礎，又為其提供了較佳的修復改善環(huán)境，綜合優(yōu)勢極為突出。本研究認為，神經營養(yǎng)因子3基因轉染的施萬細胞在脊髓損傷大鼠中的作用較佳，有利于脊髓損傷的改善，價值較高。

[1]阮文東，雪原 ，周先虎，等.自體激活雪旺細胞聯(lián)合胚胎脊髓細胞懸液修復脊髓損傷中的突觸發(fā)育過程[J].中華骨科雜志，2012，32（1）：70-76.

[2]王俊梅，曾園山.過表達NT-3 SCs和過表達TrkC NSCs移植減少脊髓損傷處瘢痕形成和促進神經再生[J].解剖學研究，2011，33（5）：367-372.

[3]董玉珍，段永壯，梁秋冬，等.Schwann細胞對大鼠坐骨神經缺損后脊髓前角運動神經元保護作用觀察[J].山東醫(yī)藥，2011，51（10）：15-16.

[4]劉通，朱濤.細胞移植治療脊髓損傷的進展[J].中華神經外科疾病研究雜志，2010，9（2）：182-183.

[5]徐云強，馮世慶，王沛，等.軟骨素酶聯(lián)合雪旺細胞移植促進脊髓損傷修復的研究[J].中華實驗外科雜志，2010，27（7）：972-975.

[6]Zhou L，Du HD，Tian HB，et al.Experimental study on repair of the facial nerve with Schwann cells transfected with GDNF genes and PLGA conduits[J].Acta Otolaryngol，2008，128（11）：1266-1272.

[7]朱玉海，馮世慶，孔曉紅，等.人臍帶間充質干細胞與自體激活雪旺細胞聯(lián)合移植修復脊髓損傷的實驗研究[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志，2009，11（8）：747-751.

[8]Raheja A，Suri V，Suri A，et al.Dose-dependent facilitation of peripheral nerve regeneration by bone marrow-derived mononuclear cells：a randomized controlled study： laboratory investigation [J].J Neurosurg，2012，117（6）：1170-1181.

[9]張燕青，曾園山，曾湘，等.神經營養(yǎng)素-3基因修飾雪旺細胞和神經營養(yǎng)素-3受體基因修飾脊髓間充質干細胞聯(lián)合移植促進脊髓損傷大鼠神經元存活的研究 [J].中國康復醫(yī)學雜志，2009，24（7）：577-581.

[10]曹紅英，曹友德.雪旺細胞與實驗性脊髓損傷修復[J].國際神經病學神經外科學雜志，2007，34（3）：252-255.

[11]宗海斌，李愛國，董玉珍.骨髓間充質干細胞分化的類施萬細胞對大鼠脊髓損傷的作用[J].廣東醫(yī)學，2012，33（22）：3384-3386.

[12]寧廣智，馮世慶，班德翔.施萬細胞移植治療脊髓損傷的研究進展[J].中華外科雜志，2009，47（16）：1267-1269.

[13]鄧興力，梁袁昕，楊智勇，等.神經營養(yǎng)因子3基因修飾神經干細胞移植脊髓損傷的相關蛋白表達[J].中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（36）：6751-6752.

[14]張強，廖維宏，王正國，等.胚胎脊髓移植兼用神經營養(yǎng)因子對大鼠損傷脊髓神經元的影響[J].神經外科學，2000，22（7）：59-60.

[15]熊敏，何寧，曾云，等.腦源性神經營養(yǎng)因子基因修飾脂肪間充質干細胞治療大鼠急性脊髓損傷[J].中華實驗外科雜志，2012，29（11）：2271-2273.

[16]蔡培強，湯遜，林月秋，等.Lentivims介導神經營養(yǎng)因子-3促進脊髓損傷大鼠功能恢復[J].中華創(chuàng)傷雜志，2005，21（7）：485-490.

[17]王彬，楊輝，何家全，等.逆轉錄病毒介導v-myc基因轉染神經干細胞的實驗研究[J].中華創(chuàng)傷雜志，2004，20（9）：55.

[18]賀曉玉，沈慧勇，項鵬，等.人神經干細胞移植對脊髓損傷大鼠后肢運動功能恢復的影響[J].中國運動醫(yī)學雜志，2010，14（2）：106-107.