射干抗病毒口服液制備工藝的研究

賈 佳 廖 欣 王興東 劉 慧 王曙東

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，江蘇南京 210002

射干抗病毒口服液是我院正在研發(fā)的一個新制劑，該品種的開發(fā)將填補我院抗病毒類中藥藥物的空白，為臨床提供一個有效的新制劑。射干抗病毒口服液處方由射干、金銀花、佩蘭、茵陳、柴胡、蒲公英、板藍根、大青葉共8 味中藥組成。經過前期研究該處方具有明確的抗病毒作用，包括呼吸道、胃腸道、角膜等部位病毒感染，也具有明顯的解熱、抑菌抗炎的作用，具有較好的臨床療效[1-7]。綜合藥材性質、有效成分的提取及工藝生產條件等因素考慮，射干抗病毒口服液選用了傳統(tǒng)的水提醇沉法進行提取。本實驗為進一步確立該口服液的制備工藝，通過正交設計試驗，以綠原酸含量為指標，對制備工藝進行優(yōu)化。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀，包括Waters 1525 二元泵、Waters 2996 二極管陣列檢測器、Millennium 32 工作站（美國Waters公司），METTLER AE240 電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥

射干為鳶尾科植物射干Belamcanda chinensis（L.）DC.的干燥根莖，金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾，茵陳為菊科植物濱蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.的干燥地上部分（經鑒定為綿茵陳），蒲公英為菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.的干燥全草，板藍根為十字花科植物菘藍Isatis indigotica Fort.的干燥根，大青葉為十字花科植物菘藍Isatis indigotica Fort.的干燥葉，柴胡為傘形科植物狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根（經王曙東教授鑒定為南柴胡），佩蘭為菊科植物佩蘭Eupatorium fortunei Turcz.的干燥地上部分。以上藥材均為飲片（安徽亳州國鑫醫(yī)藥有限公司，批號：100608），經王曙東教授鑒定均為正品。綠原酸對照品（中國藥品生物制品檢驗所，批號：110753-200413）；所用試液甲醇為色譜純，其余均為分析純。

2 方法與結果

2.1 正交試驗設計

射干抗病毒口服液的制備工藝為傳統(tǒng)的水提醇沉法，考慮到加水量（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數（C）、醇沉濃度（D）是影響提取效果的主要因素，因此以這4個因素作為考察對象，分別設置3個水平，以綠原酸含量為考察指標，選用L9（34）正交表，設計考察該口服液最佳水提醇沉制備工藝條件。因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

按L9（34）正交實驗設計要求，按處方量的十分之一準確稱取各味藥材，共9份，編為1～9號。每份250 g分別置于煎煮鍋中，分別加入純化水1 000 mL（1～3號）、1 500 mL（4～6 號）、2 000 mL（7～9 號），浸泡 0.5 h 后煎煮。煎煮時間分別為 1 h（1、4、7 號），2 h（2、5、8 號），3 h（3、6、9 號）。煎煮次數分別為 1 次（1、6、8 號），2 次（2、4、9 號），3 次（3、5、7號）。煎煮液過濾，合并濾液，每份濃縮至250 mL。冷卻，計算所需95%乙醇體積，邊順時針方向攪拌邊加入95%乙醇，分別調節(jié)乙醇濃度至 55%（1、5、9 號），70%（2、6、7 號），85%（3、4、8 號），冷藏放置 24 h，過濾取上清液，水浴加熱回收乙醇，揮去殘醇，濃縮至100 mL 以下，用純化水定容至100 mL，既得樣品。

2.2 綠原酸含量的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Lichrospher-C18 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-磷酸二氫鈉（0.78 g 加水至500 mL，用 1%磷酸溶液調 pH 至 3.4～3.6）（14∶86）；進樣量：20 μL。檢測波長：325 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫。

2.2.2 供試品的制備字體 精密吸取各工藝下的樣品2 mL，加20%甲醇定容至25 mL，0.45 μm 的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品20.30 mg，至50 mL 容量瓶中，加20%甲醇溶解并定容至刻度，制成濃度為0.406 0 mg/mL 對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液1.5 mL 至10 mL 容量瓶中，加20%甲醇稀釋定容至刻度，作為對照品溶液。

2.2.4 測定法分別精密量取對照品溶液及供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定綠原酸含量。

2.3 結果

正交試驗及方差分析情況見表2、3。

表2 正交試驗結果L9（34）

表3 方差分析表

由表2（正交試驗結果）直觀分析表明，以綠原酸含量為測定指標，極差最大的為A 因素，其次為D、C，B 因素對結果的影響很小。提取工藝影響因素的主次順序為A>D>C>B，即加水量>醇沉濃度>煎煮次數>煎煮時間。其中各因素最佳水平分別為 A3、B2、C3、D2， 即最優(yōu)試驗組合可選擇A3B2C3D2，即藥材加8倍量的水浸泡約0.5 h，煎煮2 h，重復煎煮3次，合并3次濾液并濃縮至適量，再調節(jié)乙醇濃度為70%。

結合表3 得知，以B 項為誤差項進行方差分析，結果表明，A 因素P 值小于0.05，即加水量差異有統(tǒng)計學意義差異，B、C、D 差異均無統(tǒng)計學意義。因此，考慮到生產需要，為了節(jié)約成本及減少工時將提取次數定為2次，即確定最佳提取工藝為A3B2C2D2。即藥材先以8倍量的水浸泡約0.5 h，煎煮2 h，重復煎煮2次，合并2次濾液并濃縮至適量，再調節(jié)乙醇濃度為70%。

2.4 驗證試驗

按正交試驗得到的最佳工藝進行3次驗證試驗，綠原酸含量分別為：2.24、2.48、3.04 mg/mL，平均含量為 2.59 mg/mL。綠原酸含量較高。說明該工藝科學合理，質量穩(wěn)定。

2.5 射干抗病毒口服液pH 值的篩選

按射干抗病毒口服液最佳工藝制備，精密量取10份藥液，用10%的藥用氫氧化鈉水溶液或10%鹽酸溶液調節(jié)pH 值，分別為 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，灌裝，滅菌，考察pH 值對澄明度的影響，結果見表4。

表4 射干抗病毒口服液pH值的篩選

結果顯示，在pH 值5.5～7.0 之間，射干抗病毒口服液澄明度良好。但在堿性條件下，綠原酸容易水解，故該口服液pH 值選擇在5.5～6.5 之間。

3 討論

中藥材的提取工藝多種多樣，有水浸泡、醇滲濾、水煎煮、醇回流等。其中水煎煮最為方便，易于工業(yè)化生產。在前期研究中表明，水提醇沉法是目前提取綠原酸常用的方法之一，能夠得到較高的綠原酸含量，同時該法能夠有效地控制中藥口服液的澄明度。故本實驗采用傳統(tǒng)的水提醇沉法，以綠原酸含量為指標，通過正交試驗設計，將該口服液的制備工藝進行了優(yōu)化，考慮到大生產的成本及條件，選擇A3B2C2D2為該口服液最佳制備工藝條件。

綠原酸類物質是植物在有氧呼吸過程中經桂皮酸途徑（cinnamic acid pathway）所產生的一類苯丙素類化合物[8]。研究結果表明，綠原酸具有顯著的藥理活性，對消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)均有療效。其水解產物咖啡酸亦有利膽、升高白細胞的作用。由于綠原酸療效確切，現(xiàn)在綠原酸不但是生藥的質量控制指標，也是一些成藥和制劑的質量控制指標[9]。藥理學研究證明綠原酸和咖啡酸是射干抗病毒口服液的有效成分，該口服液處方中的金銀花、蒲公英、茵陳這3 味中藥均含綠原酸，因此控制成品中綠原酸含量有重要意義。

澄明度是影響中藥口服液內在質量及外觀的重要因素，《中國藥典》2010年版規(guī)定“中藥口服液應澄清，并允許有少量搖之易散的沉淀”。中藥口服液為保證有一定的澄明度，在水提醇沉去除雜質的同時應用高速離心機等。除此之外，pH 值也是影響澄明度的重要因素，本文同時考察了pH 值對射干抗病毒口服液澄明度的影響。試驗證明，射干抗病毒口服液在pH 值5.5～7.0 之間，有較好的澄明度。但通過文獻得知[10]，綠原酸是一種縮酚酸，穩(wěn)定性差。雖然在酸性條件下，具有酚羥基結構的綠原酸以分子狀態(tài)存在損失較小，但在酸性條件下綠原酸易產生沉淀。為了確保該口服液中綠原酸含量合格，該口服液pH 值選擇在5.5～6.5 之間，并盡可能減少加工和儲存過程中綠原酸的損失。為了提高產品中綠原酸的穩(wěn)定性還可以加入合適的穩(wěn)定劑[11]。

本實驗采用流動相：甲醇-磷酸二氫鈉（0.78 g 加水至500 mL，用1%磷酸溶液調pH 值至3.4～3.6）。此處，為了使樣品峰分離度與出峰時間最優(yōu)化，故把pH 值調至3.4～3.6范圍內。

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