三白草不同藥用部位不同提取物的急性毒性研究

陳宏降 李 祥 陳建偉

1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波 315100；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210046

中藥三白草系三白草科植物Saururus chinensis（Lour.）Baill.的干燥地上部分[1]，具有清熱解毒、利水消腫的功效。部分專著記載三白草有小毒[2-3]，馬兜鈴酸及其代謝產(chǎn)物馬兜鈴內(nèi)酰胺-Ⅰ能造成腎小管上皮細(xì)胞損傷[4-5]，三白草中含有馬兜鈴內(nèi)酰胺-Ⅰ的同系物——三白草內(nèi)酰胺、馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ等內(nèi)酰胺類生物堿[6]。肉豆蔻醚和欖香脂素既是抗肝臟脂質(zhì)過氧化的有效成分亦是致幻作用的毒性成分，肉豆蔻醚在一定劑量下可導(dǎo)致肝臟脂肪變性而壞死[7-8]。前期對三白草揮發(fā)性成分的GC-MS分析表明三白草揮發(fā)油中含有大量肉豆蔻醚和欖香脂素等苯丙素類成分，尤其是根莖部位，其相對含量高達(dá)33.16%[9]。同時，本課題組及匡蕾等[10]在三白草藥效學(xué)研究時均發(fā)現(xiàn)有小鼠死亡。因此，本研究對三白草地上部分和根莖的水提物，95%乙醇提物和揮發(fā)油部位進行急性毒性研究，為臨床的安全合理使用提供一定的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 動物

健康昆明種小鼠，雌雄各半，18～22 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號為SOXK（蘇）2008-0010。

1.2 藥品與試劑

三白草購自安徽省亳州藥材市場 （地上部分產(chǎn)地湖北，批號：080908；根莖產(chǎn)地湖北，批號：080701），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為三白草科植物三白草Saururus chinensis（Lour.）Baill.的干燥地上部分及根莖，化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液的制備[11]

分別稱取三白草地上部分和根莖粗粉適量，加10倍，8倍量95%乙醇回流提取兩次（第1次2 h，第2次1.5 h），合并提取液，減壓濃縮、水浴蒸干后，用食用油-吐溫-80-水（1∶1∶8）制成含生藥 4 g/mL 的乳劑；同法制備三白草水提物，并制成含生藥4 g/mL的乳劑；采用水蒸氣蒸餾法提取三白草揮發(fā)油，并制成含生藥10 g/mL的乳劑。

2.2 不同組分樣品小鼠急性毒性預(yù)實驗[11]

取體重18～22 g健康昆明種小鼠若干只，雌雄各半，隨機分組，每組4只，禁食不禁水12 h。用5倍稀釋的不同劑量三白草供試液灌胃給藥，造成小鼠不同程度死亡，分別用0/4與4/4致死劑量組，遞增或遞減一定比例的劑量，再次實驗，找出0%和100%死亡劑量的所在范圍。

2.3 三白草醇提物的急性毒性實驗[12]

取體重18～22 g健康昆明種小鼠110只，隨機分成11組，每組10只，雌雄各半。分為三白草地上部分醇提物組，根莖醇提物組和空白對照組，實驗前禁食不禁水12 h，于次日上午灌胃給藥1次，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果三白草地上部分最大和最小致死劑量分別為40.00、12.66 g/kg，確定給藥劑量分別為 40.00、30.00、22.50、16.88、12.66 g/kg， 三白草根莖最大和最小致死劑量分別為4.50、1.42 g/kg，確定給藥劑量分別為 4.50、3.38、2.53、1.90、1.42 g/kg，空白對照組灌胃等體積食用油-吐溫-80-水（1∶1∶8）空白乳劑。常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，記錄動物反應(yīng)及死亡情況。采用改良寇氏法計算半數(shù)致死量（LD50）及95%可信區(qū)間。

2.4 三白草水提物、揮發(fā)油最大給藥劑量的測定

取健康昆明種小鼠50只，隨機分成5組，每組10只，雌雄各半。分為三白草地上部分水提物組、地上部分揮發(fā)油組、根莖水提物組、根莖揮發(fā)油組和空白對照組，實驗前禁食不禁水12 h，于次日上午灌胃給藥1次，給藥組按20 mL/kg小鼠體重灌胃給藥1次，空白對照組灌胃等體積的蒸餾水。常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，記錄動物反應(yīng)及死亡情況，計算1 d內(nèi)給藥量。

2.5 病理組織形態(tài)學(xué)檢查

對死亡的動物及時進行解剖尸檢，肉眼觀察各臟器，記錄病變情況。取其肝臟﹑腎臟﹑胸腺、大腦，經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片，厚4～5 μm，HE染色，顯微鏡下觀察。

2.6 結(jié)果

2.6.1 三白草醇提物組毒性反應(yīng) 灌胃給藥后，地上及根莖醇物提組小鼠活動明顯減少，出現(xiàn)倦怠、四肢趴伏、蜷縮成團、反應(yīng)遲鈍等癥狀，1～2 h后小鼠開始出現(xiàn)死亡，小鼠死亡主要集中在給藥后2～3 h內(nèi)，所有死亡小鼠均在給藥當(dāng)天死亡，給藥第2天以后沒有發(fā)現(xiàn)小鼠死亡，未死亡的小鼠呈抑制狀態(tài)，隨后動物飲食、體重逐漸恢復(fù)正常。

2.6.2 三白草醇提物組LD50及95%可信限 根據(jù)各劑量組小鼠累計死亡數(shù)量及給藥劑量，采用改良寇氏法計算三白草地上部分醇提物和根莖醇提物的LD50及95%可信限，結(jié)果見表1。三白草根莖95%乙醇提取物的小鼠LD50為3.15 g/kg，95%可信限為 2.264～4.382 g/kg。三白草地上部分95%乙醇提取物小鼠的LD50為17.15 g/kg，95%可信限為13.28～22.15 g/kg，分別相當(dāng)于臨床最高劑量的0.63倍和3.43 倍（臨床劑量 15～30 g，體重以 60 kg計）。

2.6.3 三白草水提物、揮發(fā)油最大給藥劑量的測定 三白草地上部分和根莖水提物的最大給藥劑量為80 g/kg，地上部分和根莖揮發(fā)油的最大給藥劑量為200 g/kg，分別相當(dāng)與臨床劑量的30倍和80倍。灌胃給藥后，小鼠未見毒性反應(yīng)及異常。

表1 三白草醇提物對小鼠LD50測定結(jié)果

2.6.4 病理學(xué)檢查 各組動物的腎臟、胸腺及大腦等臟器均未見明顯病變：腎小球體積及細(xì)胞數(shù)目無明顯改變，腎小管上皮細(xì)胞無變性壞死，間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞浸潤或纖維組織增生；胸腺皮質(zhì)、髓質(zhì)組織結(jié)構(gòu)正常。淋巴細(xì)胞未見增多和減少，間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞浸潤；大腦神經(jīng)細(xì)胞未見胞體腫脹、胞核固縮、尼氏小體消失等病理改變。膠質(zhì)細(xì)胞無增生，間質(zhì)血管無擴張充血、出血、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤等病變。三白草地上部分和根莖醇提物組動物的肝細(xì)胞均出現(xiàn)輕度變性，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞無變性、壞死，肝竇無擴張，門管區(qū)無炎癥細(xì)胞浸潤。結(jié)果見圖1。

圖1 三白草急性毒性病理切片（物鏡20×）

3 討論

三白草水提物得率較高（地上部分為10.85%，根莖為20.70%），尤其是根莖，含有較多蛋白質(zhì)、淀粉等，80 g/kg為其最大給藥劑量；三白草揮發(fā)油含量得率很低（約為2.0%），同時中藥臨床多采用煎煮法，湯劑中揮發(fā)油含量較少。因此，沒有進一步加大揮發(fā)油給藥劑量。

三白草地上部分和根莖95%乙醇提取物小鼠的LD50分別為3.15、17.15 g/kg，僅相當(dāng)于臨床劑量的0.63倍和3.43倍。而三白草水提物和揮發(fā)油在相當(dāng)于臨床劑量的80倍和200倍的情況下對小鼠均沒有表現(xiàn)出毒性，因此，可以認(rèn)為三白草的主要毒性部位為其95%乙醇提取部位，以根莖的95%乙醇提取部位尤為明顯，而水提物和揮發(fā)油基本沒有毒性。

三白草具有清熱解毒、利水消腫的功效，主要用于泌尿系統(tǒng)感染性疾病，三白草地上部分醇提物組小鼠出現(xiàn)尿量增多，尿色偏黃，死亡小鼠腹部潮濕穢濁，而根莖醇提組沒有出現(xiàn)這一癥狀。這可能與其利水功效之間存在一定的聯(lián)系，同時地上部分的LD50值較根莖大，毒性小，這也一定程度上反映了三白草在利水功效和用藥安全性方面三白草地上部分可能優(yōu)于根莖。

三白草內(nèi)酰胺和馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ為本課題組前期從三白草地上部分分離得到的內(nèi)酰胺類生物堿[4]，其為馬兜鈴酸的代謝產(chǎn)物馬兜鈴內(nèi)酰胺-Ⅰ的同系物，馬兜鈴內(nèi)酰胺-Ⅰ能夠在短時間內(nèi)迅速進入腎小管上皮細(xì)胞，造成腎小管上皮細(xì)胞的損傷，而本實驗中小鼠出現(xiàn)死亡，但僅肝臟細(xì)胞出現(xiàn)輕度變性，而腎臟等其他臟器沒有表現(xiàn)出病變，實驗中曾將三白草內(nèi)酰胺和馬兜鈴內(nèi)酰胺AⅡ按110 mg/kg劑量（約相當(dāng)于生藥量1100 g/kg）給小鼠灌胃給藥[13]，沒有發(fā)現(xiàn)小鼠死亡及毒性反應(yīng)。對于揮發(fā)油中的肉豆蔻醚和欖香脂素等苯丙素類成分，文獻報道可導(dǎo)致肝臟脂肪變性而壞死，而本實驗中揮發(fā)油在200 g/kg劑量下對小鼠均沒有表現(xiàn)出毒性反應(yīng)，對于三白草的毒性成分有待于進一步研究。

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