醇提蛋黃油對小鼠燙傷愈合作用的機(jī)理研究

謝欣梅， 龐曉斌， 叢 悅

(河南大學(xué)藥物研究所，河南開封475004)

燒燙傷是生活中常見的意外傷害，沸水、滾粥、熱油、熱蒸氣的燒燙是常會發(fā)生的事。對某些燒燙傷，如果處理不及時，就可能導(dǎo)致并發(fā)癥，如長期殘疾，住院時間延長，身體四肢的損失甚至死亡。目前臨床燒燙傷創(chuàng)面用藥已有多種，以應(yīng)用京萬紅、濕潤燒傷膏多見，但目前臨床已用的創(chuàng)面用藥不同程度地存在著創(chuàng)面感染控制不理想、疼痛加重、瘢痕增生等副作用。

蛋黃油 (又稱蛋黃脂質(zhì))是雉科動物家雞的鮮卵經(jīng)分離提取而得到的提取物，含卵磷脂、脂肪酸、鐵、鋅等多種藥用和營養(yǎng)成分。蛋黃油是傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒消腫、滋陰養(yǎng)血潤燥、斂瘡生肌長肉之功效。外用蛋黃油治病的方法在北周《集驗方》、《日華子本草》、《本草綱目》、《醫(yī)林纂要》、《本草品匯精要》等歷代專著中均有記載［1］。

蛋黃油制備方法有多種，傳統(tǒng)方法包括干餾法、烘烤法，近年來人們致力于溶劑提取、酶提取、超臨界CO2萃取等研究。關(guān)于蛋黃油的有關(guān)研究多見于臨床療效，且所用制品均為干餾法制品，療效確切、顯著［2］，但其他方法制品療效鮮有報道。由于蛋黃油的成分較多，不同的提取方法對成分的量變化又有一定的影響，所以關(guān)于蛋黃油的藥理學(xué)研究難度相對較大。

本實驗以乙醇滲漉法提取蛋黃油，在小鼠深Ⅱ度燙傷的創(chuàng)面上應(yīng)用藥物，通過對創(chuàng)面愈合率、愈合天數(shù)和創(chuàng)面皮膚的羥脯氨酸量、超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽過氧化物酶活性的檢測，研究醇提蛋黃油對燒燙傷創(chuàng)面愈合的治療作用，為蛋黃油制品的合理開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 健康昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g。由河南省實驗動物中心提供，合格證號0093638。實驗動物飼養(yǎng)在清潔級動物房。

1.2 藥物與試劑 醇提蛋黃油:本校藥物研究所提取所得。美寶濕潤燒傷膏:汕頭市美寶制藥有限公司產(chǎn)品，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z20000004。SOD、GSH-Px、HOP試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。其他試劑均為國產(chǎn)分析級。

1.3 儀器 751紫外分光光度計 (日本島津)，酶標(biāo)儀(北京普朗);高速離心機(jī) (臺式高速冷凍離心機(jī):美國雅培)，電熱恒溫培養(yǎng)箱 (上海益恒實驗儀器有限公司DHP-9272型)，F(xiàn)SH-2型可調(diào)高速組織勻漿機(jī) (江蘇省金壇市恒豐儀器廠)，多功能滲漉提取器 (EX-TE-03上海順義實驗設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 醇提蛋黃油制備 滲漉法［2-4］:取雞蛋煮熟去殼，剝?nèi)〉包S，搗碎，先用少量乙醇濕潤后裝入滲漉提取器，再加乙醇使其液面高出蛋黃粉2～3 cm靜置36 h，加8倍于蛋黃質(zhì)量的乙醇進(jìn)行滲漉，得醇油混合滲漉液，90℃回收乙醇即得蛋黃油。經(jīng)消毒滅菌后裝瓶備用，常溫下保存。此油為橘黃色透明油狀物，味芳香。

2.2 燙傷模型制備及動物分組

燙傷模型制備［5-6］:動物于試驗前24 h用硫化鈉脫毛劑脫毛后，生理鹽水洗凈，用直徑1.2 cm、高4 cm的塑料無底圓筒于脫毛處90℃水停留5 s，造成Ⅱ度燙傷，病理切片證實。

實驗動物分組:將小鼠隨機(jī)分為模型組、濕潤燒傷膏陽性對照組、醇提蛋黃油實驗組，每組30只小鼠。

于燙傷0.5 h后各組分別在燙傷部位涂抹給藥2 mL(2 g)/只，每天給藥2次，連續(xù)21 d。模型組給予生理鹽水處理。

2.3 創(chuàng)面愈合時間、愈合率測定

創(chuàng)面愈合時間:以結(jié)痂全部脫落、創(chuàng)面完全上皮化為愈合標(biāo)準(zhǔn)，觀察創(chuàng)面結(jié)痂、愈合時間及愈合動物數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗。

創(chuàng)面愈合率［6］:傷后7、14、21 d測創(chuàng)面愈合率。先將創(chuàng)面描記在半透明紙上，再以此為模板，將質(zhì)地均勻的硬紙片剪成同樣大小，然后用天平稱定質(zhì)量，以硬紙片質(zhì)量間接表示創(chuàng)面面積大小。按下式計算創(chuàng)面愈合率:創(chuàng)面愈合率 (%)=(原始創(chuàng)面面積－未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

2.4 創(chuàng)面組織勻漿制備及生化指標(biāo)檢測 傷后3、5、7、14 d各組隨機(jī)處死3只小鼠，切取創(chuàng)面組織標(biāo)本 (創(chuàng)面已愈合則取瘢痕組織)，稱定質(zhì)量，加入適量生理鹽水，冰浴條件下制成10%組織勻漿，離心15 min(3 000 r/min，4℃)后取上清液。羥脯氨酸水平測定采用比色法，超氧化物歧化酶活性測定采用黃嘌呤法，GSH-Px采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法。具體測定方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用± s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為有顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 對燙傷小鼠皮膚愈合率的影響 燙傷后多數(shù)小鼠出現(xiàn)渾身顫抖現(xiàn)象，涂抹蛋黃油后短時間內(nèi)顫抖現(xiàn)象減弱直至停止，表明蛋黃油有明顯的止痛作用。

與模型組相比，醇提蛋黃油組和濕潤燒傷膏組均可顯著縮短結(jié)痂時間和創(chuàng)面愈合時間 (P＜0.01，P＜0.01);蛋黃油實驗組小鼠瘡面結(jié)痂早于濕潤燒傷膏組 (P＜0.05)，而且創(chuàng)面更干凈;蛋黃油實驗組和濕潤燒傷膏組的創(chuàng)面愈合時間之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。小鼠在給藥7、14、21 d后各組小鼠創(chuàng)面愈合率隨時間延長而上升，在各時間段蛋黃油實驗組和濕潤燒傷膏組小鼠創(chuàng)面愈合率高于模型組，差異顯著 (P＜0.01);蛋黃油實驗組和濕潤燒傷膏對照組間也存在顯著差異 (P＜0.05)見表1，圖1。

表1 蛋黃油對小鼠皮膚愈合的影響( ± s，n=18)

表1 蛋黃油對小鼠皮膚愈合的影響( ± s，n=18)

注:與模型組比較，*P＜0.01;與濕潤燒傷膏組比較，#P＜0.05。

組 別 結(jié)痂時間/d 愈合時間/d 愈合率/%7 d 14 d 21 d醇提蛋黃油組 3.7±0.63*# 13.3±1.21*# 51.34±2.55*#94.71±4.45 98.89±1.12濕潤燒傷膏組 5.7±1.42* 15.4±1.32* 48.31±1.32* 88.96±5.78 96.45±2.87模型組 7.7±0.62 18.9±0.94 30.13±2.07 53.36±4.65 78.44±3.21

圖1 7 d及14 d小鼠燙傷創(chuàng)面圖

3.2 創(chuàng)面肉芽組織中羥脯氨酸水平 各組創(chuàng)面羥脯氨酸水 平在燙傷后呈先升后降的趨勢。傷后第3天，醇提蛋黃油組羥脯氨酸水平明顯高于模型組 (P＜0.01)，與濕潤燒傷膏組有顯著差異 (P＜0.05)。傷后第5天醇提蛋黃油組達(dá)高峰值，顯著高于模型組 (P＜0.01))和濕潤燒傷膏組(P＜0.05)。濕潤燒傷膏組第7天達(dá)高峰值，模型組到14 d達(dá)測量期間高峰。見表2。

表2 創(chuàng)面肉芽組織中羥脯氨酸水平( ± s，n=3)

表2 創(chuàng)面肉芽組織中羥脯氨酸水平( ± s，n=3)

注:與模型組比較，*P＜0.01;與濕潤燒傷膏組比較，#P ＜0.05。

組 別 羥脯氨酸/(μg·mg－1)3 d 5 d 7 d 14 d醇提蛋黃油組 17.34±2.46*# 25.67±1.97*#23.16±2.14*21.86±2.18濕潤燒傷膏組 14.17±1.52* 20.74±2.63* 23.91±1.95*21.64±3.15模型組 10.11±2.01 15.55±2.09 18.14±1.87 20.78±2.04

3.3 創(chuàng)面肉芽組織中SOD及GSH-Px活性 傷后各組SOD及GSH-Px活性均表現(xiàn)出隨時間延長而上升的趨勢。造模后3 d醇提蛋黃油組SOD、GSH-Px活性較低，但明顯高于模型組 (P＜0.01)。說明傷后創(chuàng)面內(nèi)源性的抗脂質(zhì)過氧化能力顯著降低，而醇提蛋黃油具有上調(diào)創(chuàng)面組織抗氧化的能力。傷后5、7、14 d各組 SOD活力、GSH-Px活性隨時間延長而上升，醇提蛋黃油組上升速度顯著高于模型組 (P＜0.01)，傷后5、7 d SOD活力、GSH-Px活性與濕潤燒傷膏組統(tǒng)計學(xué)差異顯著 (P＜0.05)。見表3、表4。

表3 創(chuàng)面肉芽組織中SOD活性( ± s，n=3)

表3 創(chuàng)面肉芽組織中SOD活性( ± s，n=3)

注:與模型組比較，*P＜0.01;與濕潤燒傷膏組比較，#P ＜0.05。

組 別SOD活性/(U·mg－1Pro)3 d 5 d 7 d 14 d醇提蛋黃油組 13.68±2.65* 22.42±1.97*#26.71±1.18*#29.61±1.91*濕潤燒傷膏組 12.81±1.16* 17.95±1.78* 23.16±2.43* 28.36±1.87*模型組6.64±1.92 13.61±3.45 18.32±3.27 23.74±2.98

表4 創(chuàng)面肉芽組織中GSH-Px活性( ± s，n=3)

表4 創(chuàng)面肉芽組織中GSH-Px活性( ± s，n=3)

注:與模型組比較，*P＜0.01;與濕潤燒傷膏組比較，#P ＜0.05。

組 別 SOD活性/(U·mg－1Pro)3 d 5 d 7 d 14 d醇提蛋黃油組 2.13±0.42* 2.84±0.71*# 3.12±0.67*#3.46±0.53*#濕潤燒傷膏組 1.91±0.41* 2.36±0.52* 2.53±0.93* 2.77±0.68*模型組1.17±0.52 1.75±0.43 2.16±0.47 2.31±0.72

4 討論

蛋黃油為民間廣為流傳的傳統(tǒng)中藥，其制備方法有多種，傳統(tǒng)的干餾法出油率低，環(huán)境污染嚴(yán)重，產(chǎn)品質(zhì)量不易控制，難以大規(guī)模生產(chǎn);近年來人們也比較了不同的提取方法對其成分量變化的影響［7-10］，但關(guān)于藥效學(xué)方面的研究未見報道。本研究通過實驗動物愈合率、生化指標(biāo)等檢測指標(biāo)來評價醇提蛋黃油對燙傷創(chuàng)面的影響作用。

燒燙傷后創(chuàng)面愈合時間和創(chuàng)面愈合面積百分比是評價創(chuàng)面愈合的一個綜合性指標(biāo)［11-12］。本次實驗結(jié)果表明，醇提蛋黃油可明顯促進(jìn)燙傷創(chuàng)面愈合，在縮短結(jié)痂時間和縮小疤痕面積方面更優(yōu)于濕潤燒傷膏，表明醇提蛋黃油有良好的促進(jìn)皮膚傷口愈合作用，并能顯示一定的時效關(guān)系。

燙傷后多數(shù)小鼠出現(xiàn)渾身顫抖現(xiàn)象，涂抹蛋黃油后短時間內(nèi)顫抖現(xiàn)象減弱直至停止，表明蛋黃油有明顯的止痛作用［13］。

在深度燒傷創(chuàng)面修復(fù)過程中，膠原的沉積和修復(fù)是深度創(chuàng)面愈合的突出表現(xiàn)［14-15］。羥脯氨酸在膠原中所占比例恒定，是創(chuàng)面愈合評價指標(biāo)之一。本次實驗結(jié)果顯示:本組動物造模后第5天醇提蛋黃油實驗組的羥脯氨酸量即達(dá)最高峰，明顯高于模型組 (P＜0.01);而濕潤燒傷膏組在造模后第7天的羥脯氨酸量達(dá)最高峰，提示醇提蛋黃油可有效促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)后期的膠原沉積，增加皮膚膠原纖維和膠原蛋白的水平，有利于創(chuàng)面的修復(fù)，并且效果較濕潤燒傷膏更有優(yōu)勢。

深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的表皮和真皮產(chǎn)生大量自由基，可引起明顯的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致血管通透性增加，造成燒燙傷水腫形成［16-17］。燒燙傷后皮膚的屏障功能被破壞，微生物可經(jīng)燒燙傷創(chuàng)面侵入，引起局部或全身感染，加劇氧自由基對細(xì)胞的損傷。SOD、GSH-Px是體內(nèi)常見的自由基清除劑，具有抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用［17］。本次實驗結(jié)果顯示，各組在燙傷后的第3天，創(chuàng)面SOD、GSH-Px活性均為測定點內(nèi)最低值，以后隨時間的延長上升，而醇提蛋黃油實驗組在各時間點的SOD、GSH-Px活性明顯高于模型組(P＜0.01)，說明造模后創(chuàng)面內(nèi)源性的抗脂質(zhì)過氧化能力顯著降低，而蛋黃油可以上調(diào)燙傷組織內(nèi)氧化防御系統(tǒng)的活性，保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷，減輕由此導(dǎo)致的血管通透性增加以及由此引發(fā)的感染問題。

綜上所述，本研究結(jié)果提示醇提蛋黃油具有良好的促進(jìn)燙傷創(chuàng)面愈合的作用。本實驗為打破長期以來干餾蛋黃油在臨床應(yīng)用中這種單一制品形式奠定了一定理論基礎(chǔ)。蛋黃油是個具有廣闊應(yīng)用價值的燒燙傷創(chuàng)面外用藥，其制劑的提取工藝與廣泛應(yīng)用值得深入研究。

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