杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的測定

周修騰， 何 偉， 李 勇， 顏慷祺

(1.廣東藥學院藥物研究所廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東廣州510006;2.國家中醫(yī)藥管理局“高脂血癥調(diào)肝降脂重點研究室”國家中醫(yī)藥管理局脂代謝實驗室 (三級)廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室廣東藥學院中醫(yī)藥研究院，廣東廣州510006)

杜仲系杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv．的干燥樹皮，具補肝腎強筋骨、安胎之功效［1］，主要化學成分有松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、杜仲膠等［2-4］，松脂醇二葡萄糖苷為主要特征性成分［5］。因此，松脂醇二葡萄糖苷的含有量高低是評價杜仲藥材質量的重要依據(jù)［6］。

杜仲含有大量的杜仲膠，是影響杜仲松脂醇二葡萄糖苷定量測定的主要因素之一［5］。因此，《中國藥典》2010年版一部杜仲項下含量測定方法，首先以三氯甲烷為溶劑，采用索氏回流提取法處理杜仲藥材，以除去杜仲膠，但提取時間長達12 h，且三氯甲烷屬于中等類有毒溶劑，對人體損害大［7］。故本研究采用“石油醚除膠-甲醇提取”法測定杜仲松脂醇二葡萄糖苷，并進行了方法學研究。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀，含四元梯度泵、柱溫箱、自動進樣器、DAD二極管陣列檢測器，Chromeleon 6.8色譜工作站(美國戴安公司);BT—224S型萬分之一電子分析天平 (北京Sartorius);BT—125D型十萬分之一電子分析天平 (北京Sartorius);DFY—500型搖擺式高速中藥粉碎機 (溫嶺市林大機械有限公司);UNIPREP 24(德國 UNIEQUIP)，ULTRA-GE-MK2純水儀。

1.2 試劑 松脂醇二葡萄糖苷對照品 (批號:110807-200205，定量測定用)，購于中國藥品生物制品檢定所;杜仲購于廣州致信藥業(yè)有限公司(批號分別為111001-111005)，經(jīng)廣東藥學院中藥學院李書淵教授鑒定，符合2010年版《中國藥典》一部杜仲項下規(guī)定;液相用甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，超純水自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5μm);流動相為甲醇-水 (25∶75);檢測波長277 nm;柱溫30℃;體積流量 1.0 mL/min;進樣量10μL。在此色譜條件下，松脂醇二葡萄糖苷峰與其它組分峰達到基線分離。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取松脂醇二葡萄糖苷對照品12.49 mg，置10 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，即得質量濃度為1.249 mg/mL的對照品貯備液;精密吸取貯備液1.0 mL于5 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

2.3.1 除杜仲膠方法考察 取杜仲藥材約3 g，粉碎成絮狀，精密稱定質量，加入石油醚30 mL，80℃水浴加熱回流2次，每次2 h，趁熱濾過，濾液冷至室溫，置－20℃冰箱中冷藏1 h，析出杜仲膠沉淀，濾過，棄去濾液，沉淀揮干石油醚，精密稱定質量，計算杜仲膠得率。

2.3.2 提取時間考察 參考相關文獻［8］及預實驗結果表明，當提取溫度為80℃時，杜仲膠在石油醚中的溶解度最大，故固定石油醚提取溫度為80℃，料液比為1∶10，提取次數(shù)為2次，考察提取時間分別為1 h、2 h、3 h時杜仲膠得率。從表1可以看出，提取1 h，杜仲膠得率較低;提取時間超過2 h后，杜仲膠得率變化不明顯，故將提取時間確定為2 h。

表1 提取時間對杜仲膠回收率的影響Tab.1 Effects of extraction time to solvent on extraction yield of the gum

2.3.3 料液比考察 固定提取時間為2 h，提取次數(shù)為2次，水浴提取溫度為80℃，考察料液比分別為1∶8、1∶10、1∶12時杜仲膠得率 (見表2)。從表2可以看出，料液比為1∶10時，杜仲膠得率最高。

結果表明，以石油醚為溶劑，80℃回流提取2次，每次2 h，料液比為1∶10時，杜仲膠得率較高，在該條件下除杜仲膠較為理想。

表2 料液比對杜仲膠回收率的影響Tab.2 Effects of radios of raw material to solvent on extraction yield of the gum

2.3.4 松脂醇二葡萄糖苷提取工藝條件考察 取杜仲藥材約3 g，粉碎成絮狀，精密稱定質量，加入石油醚30 mL，80℃水浴加熱回流2次，每次2 h，趁熱濾過，棄去濾液，藥渣加甲醇提取，采用正交試驗設計對影響松脂醇二葡萄糖苷提取率的主要因素:甲醇體積分數(shù) (A)、提取時間 (B)、提取次數(shù) (C)、甲醇用量 (D)進行考察。每個因素選取3個水平，因素水平見表3。以松脂醇二葡萄糖苷量為評價指標，并采用SPSS軟件對試驗結果進行直觀分析和方差分析，結果見表4、5。

表4 正交實驗結果Tab.4 Results of orthogonal tests

由極差、方差分析可知，影響松脂醇二葡萄糖苷提取效果因素大小順序排列為:甲醇體積分數(shù)(A)＞提取時間 (B)＞甲醇用量 (D) ＞提取次數(shù) (C)，其中 C為誤差項;經(jīng)F檢驗可知，A相對于誤差項C有顯著性差異 (P＜0.05)，而B、D差異并不顯著 (P＞0.05)，其中A1＞A2＞A3，B2＞B1＞B3，C2＞C3＞C1，D2＞D3＞D1，因此，松脂醇二葡萄糖苷最佳提取條件為A1B2C2D2，即15倍量純甲醇提取2次，每次2 h。

表5 方差分析結果Tab.5 Analysis of variance

按優(yōu)選工藝，取同一批次的藥材，平行三份，重復操作，在2.1項下色譜條件進行檢測。結果，杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的平均質量分數(shù)為1.326 8 mg/g。

2.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液2、5、10、15、20、30μL，注入液相色譜儀中，按2.1項下色譜條件進行分析，測定峰面積積分值，以松脂醇二葡萄糖苷微克數(shù)為橫坐標，以峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為:Y=9.577 0X－0.113 5，r=0.999 9，表明松脂醇二葡萄糖苷在0.499 6μg～7.494μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.5 精密度試驗 精密量取松脂醇二葡萄糖苷對照品溶液10μL，按2.1項下色譜條件進行測定，同法平行操作6次，測定松脂醇二葡萄糖苷峰面積，其RSD為0.73%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同一批次樣品 (批號111001)3 g，按優(yōu)選提取條件制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，分別于0、2、4、8、12、24 h各進樣10μL，測定松脂醇二葡萄糖苷峰面積，其RSD為1.55%(n=6)，表明供試品溶液在本試驗條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗 精密稱取同一批次樣品 (批號111001)3 g，平行6份，按照2.3.4項下條件制備供試品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀中，按2.1項下色譜條件進行測定，所得RSD為1.93%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.8 回收率試驗 采用加樣回收法，精密稱取已知含有量的杜仲藥材絮狀粉末，加入松脂醇二葡萄糖苷對照品溶液2 mL(質量濃度0.249 8 mg/mL)，按2.3.4項下條件制備供試品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀中，測定松脂醇二葡萄糖苷峰面積，計算含有量及回收率。見表6。

表6 加樣回收率實驗結果 (n=6)Tab.6 Results of recovery tests(n=6)

2.9 改進法與藥典法［1］比較 結果見表7。

表7 改進法與藥典法測定結果Tab.7 Com parison of the determ ination of improved methods and China pharmacopoeia(2010)

3 討論

3.1 改進法測得杜仲藥材中松脂醇二葡萄糖苷含有量高于藥典法，究其原因可能是石油醚除杜仲膠效果更好。杜仲膠是一種反式-聚異戊二烯結構［9］，主要以兩種晶體結構共存形式存在，α晶型的熔點為65℃，β晶型為55℃，加熱可使結晶態(tài)的杜仲膠破壞其晶格而溶解在溶劑中，且杜仲膠晶體完全熔融的溫度需達65℃以上，但三氯甲烷沸點61.15℃，小于杜仲膠的熔融溫度，石油醚 (60～90℃)具有與杜仲膠晶體熔點相一致的溫度范圍，能夠更徹底地除去杜仲膠［8］。前期預實驗結果也表明，采用石油醚提取杜仲膠的得率高于三氯甲烷，很好地證明了石油醚是提取杜仲膠非常理想的溶劑［8，10］，除膠更完全。

3.2 測定杜仲膠得率時，石油醚提取液需在－20℃冷凍1 h杜仲膠才能沉淀完全，原因是杜仲藥材粉碎后得到的杜仲膠在較低溫度下溶解度低，膠析出更徹底［11］。

3.3 按《中國藥典》2010年版杜仲含量測定項下條件，松脂醇二葡萄糖苷對照品和供試品用甲醇稀釋后注入色譜儀其峰形出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象，故改進法中將松脂醇二葡萄糖苷對照品及供試品采用流動相進行稀釋，其峰形較好，且分離度高。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:154．

［2］Sih C J，Ravikumt PR，Huang FC，et al．Isolation and synthesis of pinomsinol dighcosiae，a major antihyperten-sive principle of Tu-Chung［J］．JAm Chem Soc，1976，98(17):5412-5413．

［3］葉文峰．杜仲葉中化學成分、藥理活性及應用研究進展［J］．林產(chǎn)化工通訊，2004，38(5):40-44．

［4］彭密軍，周春山，雷啟福，等．杜仲中京尼平苷酸的提取工藝研究及應用［J］．中國中藥雜志，2004，29(3):229-231．

［5］姜新義，楊中林，李 萍．杜仲中松脂醇二葡萄糖苷含量測定的樣品處理方法優(yōu)化［J］．藥學進展，2009，33(1):30-33．

［6］李 偉，孫素琴，覃潔萍，等．近紅外漫反射法測定杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量［J］．中國中藥雜志，2010，35(24):3318-3321．

［7］程能林．溶劑手冊［M］．4版．北京:化學工業(yè)出版社，2007:255-258．

［8］張學俊，王慶輝，宋 磊，等．不同溫度條件下溶劑循環(huán)溶解-析出提取杜仲膠［J］．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19(6):1062-1066．

［9］周莉英，劉曉利．杜仲膠的研究現(xiàn)狀［J］．陜西中醫(yī)學院學報，2004，27(4):55-57．

［10］李學鋒，閏 晗，哪華興，等．杜仲膠的提取與熱記憶材料制備的研究［J］．塑料科技，1999，(2):18-22．

［11］何國菊．杜仲籽中油和杜仲膠的提取工藝研究［J］．貴陽學院學報，2010，6(1):14-18．