人參鱉甲煎丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高研究

王少敏， 楊新華， 夏 晶， 王 柯， 季 申

(上海市食品藥品檢驗所，上海201203)

人參鱉甲煎丸具有活血化瘀，消痞塊的作用，用于久病不愈，痙塊攻痛，風(fēng)濕痰氣，徵瘕癥母［1］，現(xiàn)代藥理研究表明人參鱉甲煎丸具有保護肝細(xì)胞、抗肝纖維化、抑制肝細(xì)胞異常增生的作用［2］，目前臨床主要用于慢性肝炎、肝硬化，心絞痛，高血脂等的治療［3］。人參鱉甲煎丸由白芍、大黃、黃芩、牡丹皮、厚樸、人參、鱉甲膠、蜣螂蟲等二十三味藥材組成，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十三冊，標(biāo)準(zhǔn)編號為WS3-B-2462-97，僅有顯微鑒別，裝量差異及溶散時限檢查項，無法有效控制藥品質(zhì)量。為更加嚴(yán)格有效地控制人參鱉甲煎丸的質(zhì)量，保證臨床用藥的有效性和安全性，本實驗建立了牡丹皮、黃芩、白芍、厚樸的薄層鑒別法和測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚5個成分的高效液相色譜法。由于人參鱉甲煎丸為二十三味生藥制成，成分復(fù)雜，在鑒別和定量測定中，藥味相互之間干擾嚴(yán)重。本實驗在建立的薄層鑒別方法中使用了多種不同的除雜質(zhì)方式制備供試品溶液，在液相定量測定方法中，采用了可見光波長，使干擾得到了有效的排除。

1 儀器與試藥

1.1 材料 人參鱉甲煎丸 (上海雷允上藥業(yè)有限公司提供，批號060401，060402，060403)，陰性對照樣品為自制。對照藥材和對照品均為中國藥品生物制品檢定所提供，批號如下:牡丹皮121490-200501、丹皮酚708-9704、黃芩苷110710-200212、芍藥苷110736-200423、厚樸酚0729-200107、蘆薈大黃素0795-9702、大黃酸0757-9804、大黃素756-200009;大黃酚110796-200311;大黃素甲醚758-9904。

1.2 儀器 高效液相色譜儀 (Agilent1100，Agilent公司);紫外-可見分光光度計 (UV—2550，Shimadzu公司)，超聲波清洗器 (B5500S—MT，必能信超聲上海有限公司，180W，42Hz);電子分析天平 (Sartorius BP 210S，北京賽多利斯天平有限公司)。

1.3 試劑、試藥 硅膠G薄層板 (德國MN公司);流動相所用甲醇為色譜純，其它試劑均為分析級。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 牡丹皮的薄層鑒別 薄層條件:硅膠G薄層板;點樣量5μL，展開劑為乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶4);檢視方式為噴以酸性5%三氯化鐵乙醇溶液，80℃加熱10 min。參照物:牡丹皮對照藥材，丹皮酚對照品。溶液制備:取丹皮酚對照品，加丙酮制成每1 mL含0.5 mg的溶液;取牡丹皮對照藥材0.5 g，加乙醚10 mL，超聲處理3次，每次3 min，合并3次超聲所得溶液，濾過，揮干，以丙酮為溶劑定容至2 mL，制成對照藥材溶液;取人參鱉甲煎丸粉末20 g，加乙醚30 mL，同法制成供試品溶液。結(jié)果:供試品色譜中具參照物的特征斑點。專屬性試驗表明，不含牡丹皮的陰性樣品無干擾 (見圖1)。

圖1 樣品中牡丹皮的TLC圖Fig.1 TLC chromatogram of Moutan Cortex in sample

2.1.2 黃芩的薄層鑒別 薄層條件:硅膠G薄層板;點樣量5μL，展開劑為水-甲酸-丁酮-乙酸乙酯(1∶1∶7∶10);檢視方式為噴5%三氯化鐵乙醇溶液。參照物:黃芩對照藥材、黃芩苷對照品。溶液制備:取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg溶液;取黃芩對照藥材1 g，加乙醇10 mL，置水浴上回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醚10 mL，浸2～3 min，傾去乙醚液，殘渣加50%甲醇2 mL使溶解，制成對照藥材溶液;再取人參鱉甲煎丸粉末10 g，加乙醇50 mL，同法制成供試品溶液。結(jié)果:供試品色譜具參照物的特征斑點。專屬性試驗表明，不含黃芩的陰性樣品無干擾 (見圖2)。

2.1.3 白芍的薄層鑒別 薄層條件:硅膠G薄層板;點樣量4μL，展開劑為甲酸-甲醇-三氯甲烷-乙酸乙酯 (0.1∶5∶2.5∶40);檢視方式為噴10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱10 min。參照物:芍藥苷對照品。溶液制備:取芍藥苷對照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg溶液;取人參鱉甲煎丸粉末15 g，以乙醇50 mL為溶劑，水浴回流提取30 min，乙醇液蒸干，加水20 mL使溶解，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次20 mL，正丁醇液依次用氨試液和正丁醇飽和的水洗滌各3次，每次20 mL，取正丁醇液蒸干，殘渣加乙醇定容至1 mL，作為供試品溶液。結(jié)果:供試品色譜具參照物的特征斑點。專屬性試驗表明，不含白芍的陰性樣品無干擾(見圖3)。

圖2 樣品中黃芩的TLC圖Fig.2 TLC chromatogram of Scutellariae Radix in sample

圖3 樣品中白芍的TLC圖Fig.3 TLC chromatogram of Paeoniae Radix alba in sam p le

2.1.4 厚樸的薄層鑒別 薄層條件:硅膠G薄層板;點樣量2μL，展開劑為甲醇-甲苯 (4∶27);檢視方式為噴1%香草醛硫酸溶液，在100℃加熱至斑點顯色清晰。參照物:厚樸酚對照品。溶液制備:取厚樸酚對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液;取人參鱉甲煎丸粉末4 g，加乙醚20 mL，超聲3 min，取乙醚液揮干，殘渣加丙酮定容至2 mL，作為供試品溶液。供試品色譜中具參照物色譜的特征斑點。專屬性試驗表明，不含厚樸的陰性樣品無干擾 (見圖4)。

2.2 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚測定

圖4 樣品中厚樸的TLC圖Fig.4 TLC chromatogram of Magnoliae Officinalis Cortex in sample

2.2.1 色譜條件及專屬性試驗 Agilent Eclipse XB-C18色譜柱 (5.0μm，4.6 mm×150 mm);檢測波長430 nm;柱溫30℃;流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液 (75∶25)，進樣量10μL。

供試品色譜圖中具與蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品保留時間一致的色譜峰，且峰型尖銳對稱，無其它成分色譜峰干擾。缺大黃的陰性樣品在蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚保留時間處無色譜峰，見圖5。

圖5 對照品 (A)、供試品 (B)和缺大黃樣品 (C)高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chrom atogram s of m ixed reference substances(A)，samp le(B)and negative samp le w ithout Rhei Radix et Rhizoma

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，以甲醇為溶劑，配制成質(zhì)量濃度分別為65 μg/mL、63 μg/mL、114 μg/mL、239 μg/mL、78.5μg/mL的對照品貯備液;再精密吸取各對照品貯備液適量，制成含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分別為6.5μg/mL、12.6 μg/mL、11.4 μg/mL、23.9 μg/mL、7.85 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 參照《中國藥典》2010年版一部“大黃”項下含量測定方法［4］，精密稱取本品粉末約2.5 g，以乙醇為提取溶劑進行回流提取1 h，取乙醇液，蒸干，殘渣以8%鹽酸-三氯甲烷 (10∶15)混合溶液為溶劑進行酸水解，酸液再用三氯甲烷提取，三氯甲烷液減壓回收至干，殘渣加甲醇使溶解并定容至10 mL，即得。

2.2.4 樣品測定方法 分別精密吸取2.2.2項下的混合對照品溶液與2.2.3項下的供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀進行測定。

2.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 精密吸取2.2.2項下混合對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為1.2%、1.2%、1.4%、1.3%、1.3%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 檢測限和線性范圍 取2.2.2項下混合對照品溶液，用甲醇稀釋至適當(dāng)濃度，進樣分析，取信噪比約為3的溶液濃度作為檢測限。分別精密吸取2.2.2項下各對照品貯備液10μL、20μL和混合對照品溶液1、2、5、10、20μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，作為縱坐標(biāo)，以進樣量 (ng)為橫坐標(biāo)，進行回歸分析，結(jié)果見表1。

表1 5種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限(n=7)Tab.1 Regression equations，correlation coefficients and detection lim its(LODs)of five compounds(n=7)

2.2.7 準(zhǔn)確度試驗 取已測定的人參鱉甲煎丸樣品 (含蘆薈大黃素51.336 9μg/g、大黃酸91.099 11μg/g、大黃素117.150 4μg/g、大黃酚208.337 8μg/g和大黃素甲醚 55.232 67μg/g)，研細(xì)，取1.25 g，精密稱定，加入按高、中、低不同量的對照品，按2.2.3項下方法制備樣品溶液，進行測定，計算回收率，結(jié)果見表2～6。

表2 樣品中蘆薈大黃素的回收率試驗結(jié)果Tab.2 Recovery tests for aloe-em odin in sam p les

表3 樣品中大黃酸的回收率試驗結(jié)果Tab.3 Recovery tests for rhein in sam ples

表4 樣品中大黃素的回收率試驗結(jié)果Tab.4 Recovery tests for emodin in samples

表5 樣品中大黃酚的回收率試驗結(jié)果Tab.5 Recovery tests for chrysophanol in sam ples

表6 樣品中大黃素甲醚的回收率試驗結(jié)果Tab.6 Recovery tests for physcion in samp les

2.2.8 供試品溶液穩(wěn)定性考察 取人參鱉甲煎丸，制備供試品溶液，于溶液制備后不同時間點 (0、2、5、9、15、22 h)進樣分析，測得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD值分別為 1.4%、0.6%、0.6%、0.3%、0.8%，表明供試品溶液在22 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.9 精密度考察 取同一批人參鱉甲煎丸，平行制備6份供試品溶液，進行測定，結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51.34μg/g(RSD為1.7%)、91.10 μg/g(RSD 為 0.9%)、117.15 μg/g(RSD 為1.8%)、208.34 μg/g(RSD 為 1.2%)、55.23 μg/g(RSD為1.5%)。結(jié)果表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.10 中間精密度考察和樣品測定 為考察隨機變動因素對精密度的影響，按照擬訂的方法，由不同人員在不同的日期、在不同儀器設(shè)備對3批樣品進行了5種化合物的定量測定，結(jié)果表明由不同的分析人員在不同的日期、不同儀器設(shè)備上測得的結(jié)果一致，方法的中間精密度良好，見表7。

表7 中間精密度試驗和樣品測定結(jié)果(n=3)Tab.7 Repetition of themethod and contents of aloe-emodin，rhein，emodin，chrysophanol，physcion in Renshen Biejiajian Pills(n=3)

3 討論

3.1 目前文獻報道的牡丹皮薄層鑒別法中［4-8］，供試品溶液制備均采用乙醚振搖方式進行提取，但人參鱉甲煎丸處方中含二十三味藥，各味藥材相互干擾，以此方法制備供試品溶液得到的色譜圖背景干擾嚴(yán)重。后分別以甲醇、乙醚作為溶劑，采用振搖、超聲處理的方法進行多次試驗，亦無法消除干擾。考慮到丹皮酚的揮發(fā)性較強，與其它成分相比，能較迅速溶解于有機溶劑，故采用較大的取樣量，以乙醚為溶劑，短時但多次超聲提取，結(jié)果顯示色譜圖背景干擾被消除，斑點清晰。同時對展開劑①乙酸乙酯-環(huán)己烷 (1∶3)、②乙酸乙酯-環(huán)己烷 (1∶4)進行了考察，結(jié)果顯示采用乙酸乙酯-環(huán)己烷 (1∶4)為展開劑時，所得到的薄層色譜斑點清晰，Rf值適中。

3.2 文獻 ［4，9］報道，黃芩的薄層鑒別方法多采用聚酰胺薄膜為薄層板，方法研究中曾參照文獻以黃芩對照藥材和黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品作為對照，采用乙酸乙酯-甲醇 (3∶1)的混合溶液回流提取制備供試品溶液，點樣于酰胺薄膜上，展開后置紫外光燈 (365 nm)下觀察，但結(jié)果顯示色譜圖中背景有較多干擾，斑點不清晰。后經(jīng)試驗采用硅膠G薄層板，以黃芩苷對照品和黃芩對照藥材為對照，采用先用乙醇回流提取，提取液蒸干，殘渣用乙醚稍浸除去極性小的雜質(zhì)，再用50%甲醇溶解，制備供試品溶液，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液顯色，結(jié)果得到的色譜圖背景干擾小，色譜斑點清晰。展開劑曾考察了2種:①甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸 (10∶3∶1∶2)，預(yù)飽和30 min、②乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水 (10∶7∶1∶1)，結(jié)果顯示第2種展開劑較好，色譜斑點Rf值適中。

3.3 參考《中國藥典》2010年版一部中“白芍”的TLC鑒別方法和相關(guān)文獻［4］，以白芍對照藥材和芍藥苷對照品作為對照，采用先乙醇回流提取，后用水飽和的正丁醇提取的制備方法，顯色方式采用噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果得到的色譜圖背景干擾較多，斑點不清晰。在原試驗方法基礎(chǔ)上，對正丁醇提取液依次用氨水、正丁醇飽和的水進行洗滌，結(jié)果背景干擾減少，色譜斑點較清晰，但空白樣品 (缺白芍)對白芍對照藥材存在部分干擾，故最終確定僅以芍藥苷對照品作為對照。

3.4 參考《中國藥典》2010年版一部中“厚樸”的TLC鑒別方法［4］，以厚樸酚對照品、和厚樸酚對照品與厚樸對照藥材作為對照，考察了甲醇、乙醚2種溶劑和振搖、超聲2種提取方法，最后確定采用乙醚超聲提取得到的色譜圖斑點清晰，方法可行。但由于人參鱉甲煎丸處方中其他藥味的干擾，陰性樣品 (缺厚樸)在和厚樸酚斑點的位置上存在干擾，故確定僅以厚樸酚對照品作為對照。

3.5 取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品混合溶液，于200～800 nm范圍內(nèi)作波長掃描，結(jié)果顯示在254 nm和430 nm處有紫外最大吸收，且254 nm處吸收度顯著高于430 nm。目前有關(guān)上述物質(zhì)測定方法的文獻報道中，亦主要采用254 nm作為檢測波長［4，10-20］，但人參鱉甲煎丸處方由二十三味藥材組成，成分復(fù)雜，在254 nm下采集得到的供試品液相圖譜中色譜峰眾多，對待測成分干擾大，經(jīng)過多種流動相系統(tǒng)和洗脫程序的摸索，無法得到待測峰與干擾峰基線分離。后選取屬可見光波段的430 nm檢測波長，結(jié)果供試品色譜圖中基本無干擾峰，在等度洗脫條件下即可達(dá)到基線分離，有效地消除了干擾，且5種物質(zhì)的檢測限均小于2ng，達(dá)到檢測要求。

3.6 在5種蒽醌類成分定量測定的供試品溶液制備方法考察中，對乙醇、甲醇、70%乙醇、50%甲醇等回流提取溶劑進行了考察，結(jié)果表明乙醇的提取效率最高，故選取乙醇作為提前溶劑。選取乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷3種溶劑對水解后萃取溶劑進行了考察，結(jié)果表明，三氯甲烷的萃取效率最完全，故確定三氯甲烷為萃取溶劑。

3.7 使用本法對所測樣品的大黃投料藥材進行了定量測定，并根據(jù)3批樣品的平均含有量計算了藥材轉(zhuǎn)移率，結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5種成分的藥材轉(zhuǎn)移率分別為:90.7%、97.7%、94.2%、99.8%、98.7%。原料到制劑的轉(zhuǎn)移率較高，這與人參鱉甲煎丸制劑為藥材直接投料有關(guān)，也證明了本方法的合理性。

3.8 曾對處方中人參和鱉甲膠進行定量測定方法的研究摸索，但本制劑中人參的投料量較少，僅為0.9%，需較大取樣量，且人參中的主要有效成分人參皂苷類物質(zhì)僅在203 nm有紫外末端吸收，而該波長下，干擾峰極多，經(jīng)過多種流動相系統(tǒng)和洗脫程序的摸索，無法得到滿意的分離度。處方中的鱉甲膠的主要有效成分為蛋白質(zhì)，多糖、氨基酸和微量元素［21］，無法采用常規(guī)方法進行分析。對此兩味投料藥材的分析將是人參鱉甲煎丸質(zhì)量控制研究的下一步方向。

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