雙黃連口服液抗炎作用的代謝組學研究

鄒忠杰， 龔夢鵑， 王淑美， 梁生旺

(廣東藥學院中藥學院，廣東廣州510006)

代謝組學 (Metabonomics)是近年來新興的一種“組學”技術，其主要是定量測定生物系統(tǒng)因病理生理或基因改變等刺激所致的動態(tài)多參數(shù)代謝應答［1］。采用代謝組學方法一方面能夠獲取生物體在外界刺激影響下代謝狀態(tài)整體性的改變，另一方面可以利用代謝標志物的變化推斷特定病理生理狀態(tài)下被調(diào)控的代謝途徑。代謝組學研究的整體性與中藥“多組分、多靶點”的作用模式相吻合，因此，代謝組學可能是科學闡釋中藥藥效與作用機制的重要途徑［2-3］。

角叉菜膠致大鼠足腫脹作為一種成熟的應用最廣的非特異性炎癥模型，已廣泛應用于抗炎藥物的篩選和藥效學評價等領域，常用藥效評價指標為大鼠足腫脹率等，但此指標靈敏度較低，而且主觀因素影響較大［4］。雙黃連口服液由金銀花、黃芩和連翹組成，具有疏風解表、清熱解毒的功效，臨床上主要用于細菌和病毒引起的感冒、流感以及肺炎、氣管炎、扁桃體炎等癥［5］。雙黃連口服液對角叉菜膠致大鼠足腫脹有明顯的抑制作用［6］，但其發(fā)揮抗炎作用的機制卻不清楚。因此，本實驗使用核磁共振 (NMR)方法建立大鼠血清及尿液的代謝指紋譜，探討炎癥引起的機體代謝狀態(tài)的變化，進而鑒定與炎癥相關的代謝標志物，并通過比較雙黃連口服液干預下這些代謝物的變化情況，探討雙黃連口服液抗炎作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠 (SPF級)，體質(zhì)量160～180 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，合格證號SCXK(粵)2008-0002。

1.2 儀器與試劑 Bruker AVANCE III 500 MHz全數(shù)字化超導核磁共振譜儀 (BrukerBiospin，Rheinstetten，Germany);PV—200足趾容積測量儀 (成都泰盟科技有限公司);雙黃連口服液 (哈藥集團三精制藥股份有限公司，批號11041004，10 mL/支);疊氮鈉 (NaN3)、氘水 (D2O)、角叉菜膠購自美國Sigma公司。

2 方法

2.1 動物分組、給藥及血清、尿液收集 將15只雄性SD大鼠置于12 h光照和12 h黑暗環(huán)境 (溫度22℃，相對濕度50%)下自由飲食。飼養(yǎng)3 d后隨機分為3組，分別為對照組、角叉菜膠炎癥模型組和雙黃連給藥組。給藥組大鼠按5 mL/kg(根據(jù)動物與人體間的等效劑量換算確定)灌胃給予雙黃連口服液，每天1次，連續(xù)5 d，對照組和模型組給予等體積蒸餾水。末次給藥30 min后，模型組和給藥組大鼠用1.0%角叉菜膠100μL/只皮下注射于左后足跖部致炎，對照組皮下注射等體積生理鹽水。隨后，各組大鼠置于具有集尿器 (放于冰上)的代謝籠中收集12 h尿液，同時加入2%NaN3溶液0.5 mL做防腐劑，收集的尿液置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｄ蛞菏占瓿珊?，于大鼠眼眶后靜脈叢取血3 mL，經(jīng)凝固 (4℃，60 min)后離心 (3 500 r/min，15 min，4℃)得到血清，置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。同時，在造模前、造模后6 h和12 h測量腫脹足跖容積，計算各大鼠足跖腫脹度和腫脹抑制率。足跖腫脹度=［致炎后足跖容積 (mL)－致炎前足跖容積(mL)］/致炎前足跖容積 (mL);腫脹抑制率 =(模型組腫脹度－給藥組腫脹度)/模型組腫脹度×100%。

2.2 血清和尿液樣本預處理 參照課題組前期研究［7］報道的方法，血清:室溫解凍后，于5 mm NMR測試管中加入400μL血清，然后加入50μL磷酸緩沖液 (0.2 mol/L Na2HPO4－0.2 mol/L NaH2PO4，pH7.4)和50μL D2O(用于鎖場)，振蕩混勻，待測。尿液:室溫解凍后，取200μL磷酸緩沖液 (0.2 mol/L Na2HPO4－0.2 mol/L NaH2PO4，pH7.4)加入到400μL尿液中，靜置20 min后離心(3 500 r/min，10min，4℃)，取500μL上清液加至5mm NMR測試管中，然后再加入50μLD2O(含有0.05%W/V TSP－d4)，振蕩混勻，待測。

2.3 血清和尿液代謝指紋譜的測試 實驗溫度為298 K;對于水峰采用有預飽和的1D NOESY脈沖序列進行抑制，對于血清中蛋白質(zhì)及脂蛋白較寬的共振信號采用Carr-Purcell-Meibom-Gill［CPMG，relaxation delay－90°－(τ－180°－τ)n-acquisition］脈沖序列進行抑制;總的回波時間2nτ=100 ms;為使采樣后的磁化矢量完全恢復到熱平衡態(tài)，弛豫延遲時間為4 s;譜寬10 kHz;采樣點數(shù)64 K;采集次數(shù)128次;傅立葉變換中線寬因子為0.3 Hz。在軟件 MestReNova 6.1(Mestrelab Research S．L，Santiago de Compostela，Spain)中手動對所獲譜圖進行相位和基線校正，然后進行化學位移的定標，血清和尿液樣品分別參照乳酸的甲基共振雙重峰(δ 1.33)和 TSP(δ0.0)［7］。

2.4 數(shù)據(jù)分析 按δ0.02等間隔在δ0.5～9.5區(qū)域分段積分，將所得數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成ASCⅡ文件輸出到Excel 2007(Microsoft Inc．，Bellevue，WA)中進行下一步處理［7］。對于血清和尿液樣品，為了消除飽和水峰時引起的譜線差異及消除由于尿素與溶劑交換質(zhì)子后發(fā)生的部分飽和轉(zhuǎn)移所造成的尿素信號差異，分別將區(qū)域δ4.74～5.22和δ4.50～5.98設為0積分段。各分段積分值進行歸一化處理后乘以10 000導入 SIMCA-P 12.0(Umetrics AB，Umea，Sweden)，進行主成分分析 (PCA)及正交偏最小二乘判別分析 (OPLS-DA)前，數(shù)據(jù)要經(jīng)過 Pareto標度化處理［7］。

3 結(jié)果

3.1 雙黃連口服液對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響 見表1，大鼠連續(xù)給藥5 d后，雙黃連口服液對角叉菜膠所致大鼠足腫脹有較好的抑制作用，與模型組相比有顯著性差異。

表1 雙黃連口服液對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響Tab.1 Effect of Shuanghuanglian Oral Liquid on carrageenan-induced hind paw oedema in rats

3.2 血清和尿液的1H-NMR代謝物譜分析 如圖1所示，血清和尿液中的代謝物主要是氨基酸類、有機酸類和酮體等物質(zhì)，除此之外，血清中還含有大量的脂蛋白和脂類物質(zhì)。

3.3 角叉菜膠致炎后大鼠機體代謝指紋譜的變化大鼠血清和尿液所含成分非常復雜，本實驗使用多變量統(tǒng)計分析中的正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)法對對照組和模型組大鼠的代謝指紋譜進行比較。如圖2所示，兩組大鼠的血清和尿液樣本點在PC1維可以完全區(qū)分開，說明角叉菜膠致炎后大鼠機體生理及物質(zhì)代謝狀況已經(jīng)發(fā)生了明顯的改變。本實驗采用7倍交叉驗證法對OPLS-DA模型的可靠性進行了驗證，主要參數(shù)如下，血清:R2X(cum)=0.82，R2Y(cum)=0.895，Q2(cum)=0.866;尿液:R2X(cum)=0.726，R2Y(cum)=0.874，Q2(cum)=0.831。從上述參數(shù)可以看出本研究建立的模型具有較高的可靠性。

圖1 對照組大鼠血清 (A)和尿液 (B)1 H-NMR圖Fig．1 Representative 1 H-NMR spectra of rat serum(A)and urine(B)samp les from the control group

圖2 對照組 (●)和模型組 (▲)大鼠血清 (A)和尿液 (B)OPLS-DA得分圖Fig．2 OPLS-DA score p lots derived from 1 H-NMR spectra of serum(A)and urine(B)sam ples in control group(●)and model group(▲)

3.4 與炎癥相關的代謝標志物鑒定 首先選取OPLS-DA模型中變量重要性投影 (Variable importance in the projection，VIP)＞1的差異變量，然后再利用t檢驗 (P＜0.05)對篩選到的差異變量進行驗證，最終在血清和尿液中分別篩選得到12種和10種與炎癥相關的代謝標志物，結(jié)果見表2、表3。

3.5 雙黃連口服液對角叉菜膠致大鼠足腫脹的干預作用 藥理研究結(jié)果表明，雙黃連口服液對角叉菜膠致大鼠足腫脹有明顯抑制作用。從大鼠血清和尿液樣本代謝指紋的主成分分析 (PCA)(見圖3)，給藥組樣本點與模型組樣本點可以完全分離，且與對照組樣本點接近。綜合這兩個方面的實驗結(jié)果可以看出雙黃連口服液有效地干預了炎癥模型大鼠的生理及代謝狀況。

4 討論

血清和尿液中通常包含眾多的代謝產(chǎn)物，NMR的技術優(yōu)勢在于可以對所有代謝產(chǎn)物同時測定，并且代謝產(chǎn)物的化學位移具有非常高的重現(xiàn)性。本實驗中代謝物譜峰的歸屬主要是依據(jù)化學位移值、峰的裂分情況、耦合常數(shù)及參考文獻報導［8-9］，同時借助于軟件 Chenomx NMR Suite 7.1(Chenomx，Inc．，Edmonton，Alberta，Canada)中代謝產(chǎn)物的自動解析功能。

表2 與炎癥相關的大鼠血清生物標志物Tab.2 Biomarkers associated w ith inflammation in rat serum

表3 與炎癥相關的大鼠尿液生物標志物Tab.3 Biomarkers associated w ith inflammation in rat urine

圖3 對照組 (●)、模型組 (▲)和給藥組 (■)大鼠血清 (A)和尿液 (B)PCA得分圖Fig.3 PCA score plots derived from 1 H-NMR spectra of serum(A)and urine(B)samples in control group(●)，model group(▲)and Shuanghuanglian Oral Liquid treatment group(■)

從表2和表3可以看出，模型組血清中葡萄糖水平下降而丙酮酸和乳酸水平升高，同時，與三羧酸循環(huán)相關的代謝產(chǎn)物的量升高，如尿液中的檸檬酸、α-酮戊二酸和琥珀酸，這是機體糖代謝加速的表現(xiàn)，急性炎癥期機體最明顯的表現(xiàn)是紅、腫、熱、痛和功能障礙，其中涉及大量的炎癥因子的釋放，對能量的需求大大增加。給藥組中雙黃連口服液可以使血清中葡萄糖水平升高、乳酸水平下降，同時使尿液中檸檬酸、α-酮戊二酸和琥珀酸水平下降，這說明其有效地干預了機體的糖代謝失衡。機體對能量需求增加還表現(xiàn)在模型組血清中低/極低脂密度蛋白及脂肪酸水平下降，由于供能需求，脂肪的轉(zhuǎn)運、分解和β-氧化作用等過程被加速。酮體是脂肪酸在肝臟中β-氧化后的中間代謝產(chǎn)物，是肝臟輸出能源的一種形式，模型組血清和尿液中的乙酰乙酸及尿液中的3-羥基丁酸和丙酮水平下降可能是機體脂質(zhì)代謝失調(diào)的一種表現(xiàn)。雙黃連口服液對脂質(zhì)代謝的作用表現(xiàn)在其對低/極低脂密度蛋白及酮體等的干預。磷脂是細胞膜和脂蛋白等的重要成分，炎癥時，機體分泌大量的磷脂酶A2，磷脂的水解導致了模型組血清中膽堿和多不飽和脂肪酸如花生四烯酸的升高，花生四烯酸是前列腺素和白三烯等炎癥因子的重要前體;同時，這也可能導致模型組血清中低/極低脂密度蛋白水平下降［10］。雙黃連口服液可以使血清中膽堿和多不飽和脂肪酸的水平下降，說明其有可能抑制了磷脂酶A2的活性，這與已報道的研究相符［11］。馬尿酸、氧化三甲胺和二甲胺均與腸道菌群的代謝有關，其水平的升高說明模型組腸道菌群受到一定同程度的影響［12］。雙黃連口服液可以調(diào)節(jié)腸道菌群。炎癥引起細胞損傷導致蛋白質(zhì)分解加速，模型組血清中氨基酸升高［10］。雙黃連口服液對炎癥模型大鼠血清中升高的氨基酸水平不能進行有效的逆轉(zhuǎn)，說明其不能阻止炎癥部位蛋白質(zhì)分解。

本實驗采用基于NMR的代謝組學方法研究了角叉菜膠致炎后大鼠機體代謝表型的變化并鑒定了相關的代謝標志物，通過雙黃連口服液對標志物的調(diào)控作用探討了其抗炎機制。代謝組反映了各種生命活動的“終點”信息，可從整體性的角度體現(xiàn)機體的變化，與傳統(tǒng)單一或孤立的藥效評價方法相比，代謝組學方法對闡釋具有“多成分、多靶點”作用特點的中藥及復方的藥效具有明顯的優(yōu)勢。

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