大鼠蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1短發(fā)夾RNA質(zhì)粒體外RNA干擾及對Hcy、ADMA的影響

方雅琴，邱 齡

同型半胱氨酸（Hcy）曾被認(rèn)為是與冠心病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的危險(xiǎn)因素，但近年幾個(gè)大型補(bǔ)充葉酸及維生素B12降低高Hcy血癥的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果徹底否定了上述觀點(diǎn)，證實(shí)降低Hcy無預(yù)防心血管事件發(fā)生的作用。很多研究發(fā)現(xiàn)血漿中非對稱性二甲基精氨酸（ADMA）與血管內(nèi)皮功能失調(diào)關(guān)系密切。國外實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)[1]，在動(dòng)物和人類中高Hcy血癥常伴有ADMA濃度增高。Ⅰ型蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（PRMTⅠ）是 Hcy與ADMA的合成代謝通路交點(diǎn)上關(guān)鍵的限速酶，其基因表達(dá)及活性的增高在理論上可引起血漿 Hcy、ADMA增高，研究發(fā)現(xiàn)PRMT1在冠心病病人心肌組織中過度表達(dá)[2]，從而推測該酶是引起冠心病發(fā)病同時(shí)Hcy及ADMA水平升高的重要危險(xiǎn)因素。本實(shí)驗(yàn)在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上觀察pPRMT1－shRNA質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)染大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，對PRMT1基因mRNA表達(dá)和Hcy、ADMA水平的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與實(shí)驗(yàn)儀器 細(xì)胞總RNA抽提試劑盒Trizol及逆轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTP購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司，PCR引物購自Invitrogen公司，RT－PCR試劑盒美國Fermentas公司，DNA Marker購自大連寶生物有限公司，IX51熒光倒置顯微鏡為日本Olympus公司生產(chǎn)，ELISA法ADMA檢測試劑盒及Hcy檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1d，在6孔板中進(jìn)行細(xì)胞鋪板，每孔接種3.0×105個(gè)細(xì)胞，孵育過夜。觀察達(dá)到轉(zhuǎn)染要求時(shí)，以每兩孔為一組，共分為4組?？瞻讓φ战M：未作任何處理；陰性對照 質(zhì) 粒 組 ：轉(zhuǎn) 染pHK；pPRMT 1－shRNA 1組 ；pPRMT 1－shRNA2組。按質(zhì)粒3.0μg、jetPEITM－RGD 6μL制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物。分別于轉(zhuǎn)染后12h和24h收集4組細(xì)胞和上清液，用RT－PCR檢測各組PRMT1基因的表達(dá)。

1.2.2 RT－PCR檢測各組PRMT1基因的表達(dá) 細(xì)胞總RNA的提取按照Trizol試劑說明書。RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增 （大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞PRMT1及內(nèi)參β－actin引物見表1）。瓊脂糖凝膠電泳。ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中Hcy及ADMA含量。

表1 PCR引物

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染12h、24h后PRMT1基因mRNA表達(dá)（見圖1、表2） 空白對照組與陰性對照質(zhì)粒組的PRMT1基因mRNA 表達(dá)無明顯差異，pPRMT1－shRNA1組、pPRMT1－shRNA2轉(zhuǎn)染組與空白對照組、陰性對照質(zhì)粒組比較，PRMT1基因mRNA表 達(dá) 明 顯 降 低 （P＜0.01），pPRMT1－shRNA1 組、pPRMT1－shRNA2轉(zhuǎn)染組組間以及組內(nèi)24h與12h比較，PRMT1基因mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 RT－PCR檢測各組PRMT1基因mRNA表達(dá)

表2 各組PRMT1基因與內(nèi)參β－actin條帶的吸光度值的相對值（±s）

表2 各組PRMT1基因與內(nèi)參β－actin條帶的吸光度值的相對值（±s）

組別 轉(zhuǎn)染12h后 轉(zhuǎn)染24h后空白對照組1.143±0.023 1.182±0.026陰性對照質(zhì)粒組 1.120±0.047 1.176±0.028 pPRMT1－shRNA1組 0.910±0.0551） 0.836±0.0231）3）pPRMT1－shRNA2組 0.992±0.0151）2） 0.917±0.0341）2）3）與空白對照組、陰性對照質(zhì)粒組，1）P＜0.01；與pPRMT1－shRNA1組比較，2）P＜0.05；與同組轉(zhuǎn)染12h后比較，3）P＜0.05

2.2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中Hcy、ADMA含量比較（見表3） 空白對照組與陰性對照質(zhì)粒組Hcy、ADMA水平無明顯差異，pPRMT1－shRNA1組、pPRMT1－shRNA2轉(zhuǎn)染組與空白對照組、陰性對照質(zhì)粒組比較，Hcy、ADMA水平明顯下降（P＜0.01）；pPRMT1－shRNA1組、pPRMT1－shRNA2轉(zhuǎn)染組組間以及組內(nèi)24h與12h比較，Hcy、ADMA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中HCY、ADMA含量比較（±s） μmol／L

表3 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中HCY、ADMA含量比較（±s） μmol／L

組別 HCY轉(zhuǎn)染12h后 轉(zhuǎn)染24h后ADMA轉(zhuǎn)染12h后 轉(zhuǎn)染24h后空白對照組 5.000±0.860 5.173±0.966 1.255±0.318 1.299±0.357陰性對照質(zhì)粒組 4.902±1.732 5.145±1.021 1.230±0.441 1.292±0.378 pPRMT1－shRNA1組 3.982±2.0161） 3.660±0.8381）3） 0.999±0.7461） 0.919±0.3101）3）pPRMT1－shRNA2組 4.340±0.5581）2） 4.011±1.2381）2）3） 1.089±0.2071）2） 1.007±0.4581）2）3）與空白對照組、陰性對照質(zhì)粒組，1）P＜0.01；與pPRMT1－shRNA1組比較，2）P＜0.05；與同組轉(zhuǎn)染12h后比較，3）P＜0.05

3 討 論

2006年發(fā)表[3－5]的幾個(gè)大型臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)降低 Hcy無預(yù)防心血管事件發(fā)生的作用。這對既往的Hcy增高引起動(dòng)脈粥樣硬化理論產(chǎn)生了極大的質(zhì)疑，并推測Hcy可能只是一個(gè)無辜的旁觀者。之后進(jìn)行的研究[6]推測維生素缺乏引起的高同型半胱氨酸血癥可以簡單通過補(bǔ)充缺乏的維生素治療，但基因缺陷或同型半胱氨酸代謝酶的突變引起的高同型半胱氨酸血癥則必須用其他的治療方法控制。

血漿中內(nèi)源性一氧化氮合酶競爭性抑制劑非對稱性二甲基精氨酸與血管內(nèi)皮功能失調(diào)關(guān)系密切，ADMA在動(dòng)脈粥樣硬化、高膽固醇血癥、心力衰竭等相關(guān)疾病中也是升高的[7]，是急性心血管事件獨(dú)立的預(yù)測因子。在動(dòng)物和人類中高Hcy血癥常伴有血漿ADMA濃度增高。通過研究二者代謝過程，找到了存在于Hcy、ADMA合成代謝中關(guān)鍵的限速酶——Ⅰ型蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（PRMTⅠ），其基因表達(dá)及活性的增高理論上可引起血漿Hcy、ADMA增高，ADMA可抑制一氧化氮合酶（NOS）而可能導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂。

體內(nèi)許多細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核中帶有L－精氨酸殘基的蛋白質(zhì)，在PRMT作用下以SAM為甲基供體，生成甲基化蛋白質(zhì)，后者水解后產(chǎn)生甲基化精氨酸。根據(jù)PRMT底物特異性及反應(yīng)產(chǎn)物將其分為兩型：PRMTⅠ和PRMTⅡ，PRMTⅠ使蛋白甲基化后經(jīng)水解釋放ADMA和單甲基精氨酸（NMA），而PRMTⅡ使蛋白甲基化后經(jīng)水解釋放對稱性二甲基精氨酸和NMA。ADMA和NMA均可抑制NOS，在血漿中ADMA的正常水平為（1.0±0.1）μmol／L，約為 NMA的10倍，因而 ADMA是NOS的主要抑制劑。

PRMT1是人類細(xì)胞中占優(yōu)勢的PRMTⅠ，存在于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，承擔(dān)了所有精氨酸甲基化反應(yīng)的至少85%，PRMT1以可被檢測到的水平表達(dá)存在于所有被檢測的組織中[8]，但人們對PRMT1活性的調(diào)節(jié)到目前為止所知甚少。如果基因干擾PRMT1，則體內(nèi)的精氨酸甲基化反應(yīng)大大減少，從理論上說減少了Hcy和ADMA的產(chǎn)生。Chen等[2]的研究結(jié)果提示冠心病患者PRMT1表達(dá)增加，間接支持PRMT1基因表達(dá)增加有促動(dòng)脈粥樣硬化作用的想法，故而本研究選擇PRMT1作為基因干擾的靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)用前期構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPRMT1－shRNA1和pPRMT1－shRNA2，以前期試驗(yàn)獲得的最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件轉(zhuǎn)染原代大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，RT－PCR檢測各組轉(zhuǎn)染后12h及24h PRMT1基因表達(dá)，ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中Hcy及ADMA含量。結(jié)果表明，空白對照組與陰性對照質(zhì)粒組的PRMT1基因mRNA表達(dá)、Hcy、ADMA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組與空白對照組、陰性對照質(zhì)粒組比較sPRMT1基因mRNA表達(dá)明顯降低，且Hcy、ADMA水平明顯下降；且隨著PRMT1基因mRNA表達(dá)水平的降低，Hcy、ADMA水平下降更明顯。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的PRMT1－shRNA1和PRMT1－shRNA2質(zhì)?？筛咝У靥禺愋缘鼗虺聊笫笱軆?nèi)皮細(xì)胞PRMT1基因，且隨著PRMT1基因mRNA表達(dá)水平的降低，Hcy、ADMA水平也相應(yīng)下降。本實(shí)驗(yàn)為更進(jìn)一步構(gòu)建PRMT1－shRNA重組腺病毒載體在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究PRMT1基因水平與ADMA、Hcy水平的關(guān)系及對冠心病的影響打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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