扶芳藤合劑對兔病態(tài)竇房結(jié)綜合征Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達的影響1）

朱智德，盧健棋，韋 斌，姜 浩，王慶高

病態(tài)竇房結(jié)綜合征（sick sinus syndrome，SSS）是由于心臟竇房結(jié)及其周圍組織的結(jié)構(gòu)與功能的病理改變，導(dǎo)致心肌起搏功能和／或心肌傳導(dǎo)束沖動傳導(dǎo)障礙，產(chǎn)生各種心律失常的綜合征。竇房結(jié)（atrionector）是心臟的最高起搏點。竇房結(jié)由P細(xì)胞、T細(xì)胞和心房肌細(xì)胞所組成：P細(xì)胞（起搏細(xì)胞、竇房結(jié)細(xì)胞）形圓小（5μm～10μm）、色淡蒼白（pale）、分化程度低、類似原始心肌細(xì)胞。具有自動起搏的特性。竇房結(jié)細(xì)胞聯(lián)結(jié)包括P－P細(xì)胞（起搏細(xì)胞）、P－T（移行細(xì)胞）、T－T細(xì)胞、T－心房肌細(xì)胞之間的連接，其連接方式包括縫隙連接（gapjunction，GJ）、橋粒（desmosome）和黏著連接（adhering junction）三種?？p隙連接蛋白（connexin，Cx）是構(gòu)成細(xì)胞間GJ的分子基礎(chǔ)。縫隙連接由連接蛋白家族跨膜蛋白組成，研究已確定在心臟表達的Cx家族成員主要有Cx43、Cx40、Cx45。

中醫(yī)學(xué)根據(jù)SSS的臨床表現(xiàn)，多將其歸屬于“心悸”、“頭暈”、“胸痹”、“厥證”、“脈遲癥”、“脈結(jié)代”等范疇。復(fù)方扶芳藤合劑主要由扶芳藤、人參、黃芪等藥組成，有益氣行血，溫補心脾腎之功。在臨床中發(fā)現(xiàn)扶芳藤合劑對SSS有較好的療效，其作用機制尚未明了。本實驗在成功建立家兔SSS模型的基礎(chǔ)上，通過觀察扶芳藤合劑對竇房結(jié)細(xì)胞Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達的影響，探討其治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性家兔40只，體重（2.5±0.5）kg，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，常規(guī)飼養(yǎng)，自由進食進水。

1.2 實驗藥品和試劑 復(fù)方扶芳藤合劑由廣西中醫(yī)學(xué)院制藥廠提供（規(guī)格：每支10mL）；心寶丸，廣東省藥物研究所制藥廠生產(chǎn)（規(guī)格：每丸60mg），以蒸餾水配成0.2g／mL供家兔灌胃用。CX45、CX43蛋白特異性一抗（Rabbitanti－45，Rabbitanti－43，Rabbitanti－4，美國Sigma公司）

1.3 實驗儀器 電生理儀，常用手術(shù)器械，DF -5A心臟電生理刺激儀 （蘇州市東方電子儀器廠），針形四極心電電極（廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心提供），DH- 140動物人工呼吸機（浙江醫(yī)科大學(xué)儀器實驗廠），BMJ -1型生物組織包埋機（上海京工實業(yè)有限公司），RM2315切片機（德國Leica公司），奧林巴斯BX51T生物顯微鏡（型號BX51T-32F01，日本OLYMPUS公司），奧林巴斯顯微照相機（型號 C－7070，日本 OLYM－PUS公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組與給藥方法 將40只大耳白兔按隨機數(shù)字表隨機分為正常組（A組）、模型組（B組）、復(fù)方扶芳藤合劑高劑量組（C組）、復(fù)方扶芳藤合劑低劑量組（D組）、心寶丸組（E組），每組8只。正常組不進行造模，其余各組于模型成功后第5天開始灌胃給藥，連續(xù)2周，每天1次。C組給予復(fù)方扶芳藤合劑3.6g／（kg·d），D組給予復(fù)方扶芳藤合劑0.9g／（kg·d），E組給予心寶丸0.3g／（kg·d）。A組、B組以等體積的生理鹽水灌胃。

1.4.2 SSS模型制作 取以3%戊巴比妥鈉30mg／kg耳緣靜脈麻醉。四肢皮下固定針形心電電極并連接至BL－420F生物機能實驗儀，記錄體表心電圖。氣管插管連接呼吸機，潮氣量22mL。沿胸骨正中右緣2mm～3mm剪斷第2～4肋骨，縱行開胸，注意避免損傷右胸膜，經(jīng)縱隔打開心包，暴露右心房及右心耳。用干棉簽拭干心臟竇房結(jié)區(qū)（右上腔靜脈與右心房交界處），用20%甲醛溶液浸潤2mm×3mm棉球外敷竇房結(jié)區(qū)3 min～5min，當(dāng)出現(xiàn)心率較濕敷前下降30%～50%，出現(xiàn)竇性停搏、快慢綜合征、竇房阻滯或結(jié)性逸搏為竇房結(jié)急性損傷模型成功標(biāo)志。取出棉球，持續(xù)觀察1h，待心率穩(wěn)定，青霉素生理鹽水沖洗胸腔，逐層關(guān)胸。

1.4.3 竇房結(jié)取材 行竇房結(jié)電生理功能檢測后于耳緣靜脈注入空氣栓塞致死，迅速取出心臟并用生理鹽水沖洗，分離出右心耳及上、下腔靜脈，剪開上、下腔靜脈，于上腔靜脈入口以下至從腔耳角向外下沿界嵴到下腔靜脈口這一區(qū)域切取竇房結(jié)組織，將組織修剪為3mm×4mm的組織塊，浸泡于4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.4.4 竇房結(jié)組織Cx45、Cx43、Cx40蛋白表達的檢測 采用SABC三步法：切片常規(guī)脫蠟至水，3%的H2O2以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水洗3次。再將切片浸入0.01mol／L的枸櫞酸鹽緩沖液（pH＝6.0）微波爐中加熱3min，冷卻后PBS洗滌2次，5%BSA室溫下封閉20min，滴加適當(dāng)（50μL）稀釋一抗（兔抗鼠多克隆抗體）4℃過夜；PBS沖洗，滴加生物素化三羊抗兔IgG，37℃20min，沖洗后滴加試劑SABC，37℃20min，再次沖洗后DAB室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，及時終止。蘇木染色、脫水、透明、封片。對照組設(shè)計：以PBS代替一抗為陰性對照。陽性為棕黃色，陰性不顯色。用Image－pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，每張切片隨機選取3個高倍視野測定免疫組化圖像中平均光密度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 19.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，檢驗采用雙側(cè)檢驗。

2 結(jié) 果

手術(shù)造模后模型組竇房結(jié)組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達下降，明顯低于正常組，經(jīng)過藥物干預(yù)后，復(fù)方扶芳藤合劑大、小劑量中藥組竇房結(jié)組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達增高，其中，大劑量組竇房結(jié)組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達明顯高于模型組（P＜0.05）；而大劑量組與心寶丸組比較，竇房結(jié)組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。小劑量組干預(yù)后竇房結(jié)組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達較模型組增高，其中Cx40較模型明顯增高（P＜0.05）。詳見表1。

表1 竇房結(jié)組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達（±s）

表1 竇房結(jié)組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達（±s）

組別 n Cx45 Cx43 Cx40 A組6 0.321±0.012 0.329±0.010 0.332±0.007 B組 6 0.281±0.008 0.259±0.009 0.280±0.011 E組 6 0.310±0.0112） 0.313±0.0132） 0.323±0.0122）C組 6 0.296±0.0101） 0.275±0.0091）4） 0.318±0.0152）D組 6 0.314±0.0132）3） 0.326±0.0162）3） 0.339±0.0142）3）與A組比較，1）P＜0.05；與B組比較，2）P＜0.05；與C組比較，3）P＜0.05；與E組比較，4）P＜0.05

3 討 論

竇房結(jié)是哺乳動物心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的重要組成部分，是控制心臟電活動的中心，竇房結(jié)細(xì)胞間相互連接的獨特性便決定著細(xì)胞間電傳導(dǎo)的特殊性。在竇房結(jié)組織中，Cx主要有兩個職能：①維持心臟正常節(jié)律；②將沖動傳到心房且不受超激化的影響[1]。已證實在心臟表達的Cx家族成員主要有Cx43、Cx40、Cx45。運用免疫組化和電生理方法研究竇房連接區(qū)GJ特征，結(jié)果兔竇房結(jié)中央P細(xì)胞表達Cx40，在結(jié)周圍混合表達Cx43、Cx40[2]。Coppen等[3]對兔心臟免疫組化共聚焦顯微鏡觀察研究發(fā)現(xiàn)Cx45和Cx40竇房結(jié)中央表達，竇房結(jié)與界嵴交界區(qū)大部分區(qū)域顯示在界嵴表達Cx43心肌細(xì)胞與結(jié)區(qū)表達Cx 45和Cx40細(xì)胞有明顯的分界線，然而在心臟內(nèi)面竇房結(jié)周圍與界嵴的過渡帶共同表達Cx43和Cx45。竇房結(jié)組織損傷后，必將影響竇房結(jié)細(xì)胞間的特化連接，引起細(xì)胞間電偶聯(lián)與機械耦聯(lián)異常使竇房結(jié)功能下降，導(dǎo)致相應(yīng)傳導(dǎo)速度和各向異性傳導(dǎo)發(fā)生改變，從而出現(xiàn)傳導(dǎo)減慢及傳導(dǎo)阻滯等現(xiàn)象，引起各種心律失常，故對Cx表達的干預(yù)情況，可以作為評價治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征藥物作用之一。

病態(tài)竇房結(jié)綜合征動物模型較多，各有不同的特點，用甲醛溶液濕敷竇房結(jié)區(qū)建立病態(tài)竇房結(jié)綜合征模型的方法被廣泛用于基礎(chǔ)實驗研究。此法操作簡單，容易被實驗人員掌握，對竇房結(jié)損傷程度較輕，損傷后去除甲醛溶液，心肌組織功能還能一定程度的恢復(fù)，因此，實驗進程容易能被實驗人員掌控。在實驗過程中采用從胸骨右緣縱行開胸，經(jīng)縱隔打開心包，可以避免破壞胸膜腔，減少了氣胸等并發(fā)癥的發(fā)生[4]。

中醫(yī)學(xué)里沒有“病態(tài)竇房結(jié)綜合征”的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，多將其歸屬于“心悸”、“頭暈”、“胸痹”、“厥證”、“脈遲癥”、“脈結(jié)代”等范疇。對其病機，古代早有論述。如《素問·痹論》亦指出：“脈痹不已，復(fù)感于邪，內(nèi)舍于心”，“心痹者，脈不通，煩則心下鼓”，《瀕湖脈學(xué)》云：“遲而無力定虛寒，代脈都因元氣虛，結(jié)脈皆因氣血凝”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為病態(tài)竇房結(jié)綜合征以陽氣虛衰為本，即以心陽虛、腎陽虛、脾陽不足為主；寒凝氣滯、血瘀、痰濁為標(biāo)，乃本虛標(biāo)實之證。血瘀、寒凝、痰濕等標(biāo)實均因陽氣不足而成，而陽虛則為氣虛之甚，故病竇之治應(yīng)以益氣助陽為法，尤應(yīng)以大補元氣為治療關(guān)鍵。

復(fù)方扶芳藤合劑主要由扶芳藤、人參、黃芪等藥組成，扶芳藤補腎強筋，行氣活血；現(xiàn)代藥理發(fā)現(xiàn)扶芳藤具有良好的心血管藥理作用，可延長小鼠心肌缺氧的存活時間，抑制血栓形成，改善去甲腎上腺素（NA）所致的腸系膜微循環(huán)障礙，并可擴張耳廓微血管。人參大補元氣，現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，人參含有人參皂苷等多種有效成分，具有強心、升壓、興奮心臟，增強心肌收縮縮，提高心率的作用。黃芪補益心氣 ，填補胸中宗氣，以助心陽而令血行?，F(xiàn)代藥理研究表明其主要成分有改善心功能 ，改善心肌代謝等作用。人參、黃芪還具有強心、升壓、提升心率及擴張血管，增加冠脈血流量，改善心肌缺血，改善微循環(huán)與抗血小板聚集等作用。諸藥合用，共奏益氣行血，溫補心脾腎之功，使心氣充裕，心陽振奮，心肌鼓動有力，心率增加，諸癥緩解。同時，復(fù)方扶芳藤合劑是具有抗心肌缺氧、抗衰老、抗應(yīng)激、改善微循環(huán)等作用。

本研究結(jié)果提示，大劑量的復(fù)方扶芳藤液對竇性心律失常有明顯的調(diào)節(jié)作用，研究顯示大劑量復(fù)方扶芳藤液能提高心率，其治療機制可能與降低竇房結(jié)恢復(fù)時間（SNRT）、校正竇房結(jié)恢復(fù)時間（CSNRT）、竇房傳導(dǎo)時間（SACT），提高竇性心律，促進竇房結(jié)組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達有關(guān)。小劑量的復(fù)方扶芳藤液對竇性心律失常也有一定的調(diào)節(jié)作用，研究顯示小劑量復(fù)方扶芳藤液也能提高心率，降低SACT、SNRT、CSNRT，提高竇性心律，促進竇房結(jié)組織Cx45、Cx43及Cx40蛋白表達，實驗數(shù)據(jù)雖然與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但在小劑量的基礎(chǔ)上適當(dāng)再增加劑量可能對竇房結(jié)病變的預(yù)防有意義，因此小劑量的復(fù)方扶芳藤液需要進一步研究。

本次試驗研究能證實復(fù)方扶芳藤合劑對SSS有良好的療效，并進一步揭示其分子作用機理，必將擴大復(fù)方扶芳藤合劑的臨床應(yīng)用范圍，從而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。鑒于中藥治療的多靶點性，該藥的其他藥理作用尚待進一步挖掘并加以證實。

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