參附注射液對(duì)原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧－復(fù)氧損傷的影響

王建剛，田首元

參附注射液（Shen－fu injection，SFI）是臨床上常用的中藥，其主要藥理成分為人參皂苷和烏頭堿，對(duì)心肌缺血／再灌注損傷具有保護(hù)作用[1，2]，但其作用機(jī)制還有待探討。本研究采用原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞建立缺氧／復(fù)氧（hypoxia／reoxygenation，H／R）損傷模型模擬體內(nèi)缺血／再灌注損傷，研究SFI對(duì)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞H／R損傷的保護(hù)作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 參附注射液（批號(hào)：041105，雅安三九藥業(yè)有限公司），胎牛血清、低糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國(guó)），胰蛋白酶（Amresco公司，美國(guó)），倒置相差顯微鏡（Olympus Optical公司，日本），CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Forma Scientific公司，美國(guó)）。5－溴－2－脫氧尿核苷（5－bromo－2－deoxyuridine，BrDU）。DXC800型全自動(dòng)生化分析儀、Access2型免疫化學(xué)發(fā)光分析儀（Beckman公司，美國(guó)），超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。EPICS Elite型流式細(xì)胞儀（Beckman coulter公司，美國(guó)）。

1.2 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 取出生1d～3dWistar乳鼠，雌雄不限（山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供），75%酒精浸泡后，無(wú)菌條件下取其心臟置于預(yù)先盛有D－Hanks液的無(wú)菌平皿內(nèi)，用含抗生素的D－Hanks灌沖洗兩遍。取心室肌剪碎至1mm3～2 mm3大小的組織塊，移入5 0mL離心管中，用適量預(yù)溫的0.125%胰蛋白酶和0.01%EDTA 37℃水浴震蕩分次消化，每次約8min，直至組織塊完全消化。收集除第1次以外的單細(xì)胞懸液，放入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，終止消化7目篩網(wǎng)過(guò)濾去除未消化的組織，在4℃時(shí)以1 000r／min離心10min，棄上清，收集沉淀，加入培養(yǎng)液（80%DMEM、20%胎牛血清、青霉素100U／mL、鏈霉素100U／mL和0.1mmol／L Br－DU）混懸。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×106／L。接種到25mL培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)箱（含95%空氣＋5%CO2）中培養(yǎng)2h以純化心肌細(xì)胞（差速貼壁法）。接種到24孔培養(yǎng)板中，每24h觀察細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)情況，并更換培養(yǎng)液。其中BrDU在細(xì)胞培養(yǎng)36h內(nèi)加入以抑制非心肌細(xì)胞增殖。接種3d～4d后，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)24h，使細(xì)胞周期同步化后行缺氧／復(fù)氧干預(yù)。

1.3 心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷模型建立 參照文獻(xiàn)[3]的方法以及具體實(shí)驗(yàn)條件加以改進(jìn)。上述原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞棄上清，換以經(jīng)95%N2＋5%CO2混合氣體飽和的低糖、無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，置于37℃密閉容器內(nèi)（含95%N2＋5%CO2混合氣體）缺氧1h后，取出更換為以95%空氣＋5%CO2混合氣體飽和的高糖、含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃孵箱（含95%空氣＋5%CO2）中復(fù)氧3h。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分4組。正常對(duì)照組（C組）：37℃孵箱中持續(xù)孵育4h，未經(jīng)缺氧／復(fù)氧處理；缺氧／復(fù)氧損傷模型組（H／R組）：給予培養(yǎng)的心肌細(xì)胞單純?nèi)毖?h，復(fù)氧3h。缺氧／復(fù)氧＋低劑量SFI組（SFI－L組）：在缺氧前30 min加入終濃度為50μmol／mL的SFI，再缺氧1h／復(fù)氧3h；缺氧／復(fù)氧＋高劑量SFI組（SFI－H組）：在缺氧前30min加入終濃度為100μmol／mL的SFI，再缺氧1h，復(fù)氧3h。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 上清液肌酸激酶同工酶（CK－MB）、心肌肌鈣蛋白I（cTn－I）含量測(cè)定 復(fù)氧末取細(xì)胞上清培養(yǎng)液，置－20℃ 冰箱保存批量待測(cè)。分別由Beckman DXC800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定CK－MB含量，化學(xué)免疫發(fā)光法檢測(cè)cTn－I含量。

1.5.2 心肌細(xì)胞MDA含量和SOD活性的檢測(cè) 用硫代巴比妥法（TBA）測(cè)定MDA含量，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性。操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5.3 心肌細(xì)胞凋亡率測(cè)定 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)75%胰蛋白酶消化貼壁心肌細(xì)胞，消化分離后收集到試管中離心10min（1 000r／min），將細(xì)胞懸液用1mL空針抽吸兩遍制成單細(xì)胞懸液，懸于70%冷乙醇（4℃）過(guò)夜。檢測(cè)時(shí)離心10 min（1 000r／min），PBS洗去乙醇。細(xì)胞沉淀用PI 4℃避光染色30min，上機(jī)檢測(cè)。G期前的亞二倍體峰即代表凋亡峰，反映凋亡細(xì)胞的百分比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較應(yīng)用SNK－q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

與C組比較，H／R組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液CK－MB、cTn－I含量、心肌細(xì)胞內(nèi)MDA含量以及凋亡指數(shù)顯著上升，SOD活性顯著下降 （P＜0.01）。與 H／R 組 比 較，SFI－L 組、SFI－H 組 中除SOD活性顯著上升外，上述其他指標(biāo)均顯著下降（P＜0.01）。SFI－L組和SFI－H組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 各組CK－MB、cTn－I、MDA含量、SOD活性及凋亡指數(shù)比較（±s）

表1 各組CK－MB、cTn－I、MDA含量、SOD活性及凋亡指數(shù)比較（±s）

組別 n CK－MB（U／L） cTn－I（ng／mL） MDA（nmol／L） SOD（nU／mL） 凋亡指數(shù)（%）C組 10 1.20±0.43 0.012±0.007 6.29±0.91 26.37±2.86 3.11±0.45 H／R組 10 10.38±2.411） 0.901±0.0141） 21.76±2.631） 13.12±3.111） 20.22±3.241）SFI－L組 10 5.25±1.401）2） 0.465±0.0221）2） 15.47±1.631）2） 19.22±2.051）2） 8.66±1.251）2）SFI－H組 10 4.63±1.251）2） 0.431±0.0181）2） 14.10±1.421）2） 21.05±2.331）2） 7.46±1.441）2）與C組比較，1）P＜0.01；與 H／R組比較，2）P＜0.01

3 討 論

本研究所用SFI為臨床常用針劑型，結(jié)合以往研究及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇SFI濃度為50μmol／mL和100μmol／mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[4，5]。CK－MB和cTn－I正常情況下存在于心肌細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)心肌細(xì)胞受損或壞死后就溢出胞外，釋放水平愈高，則代表細(xì)胞損傷壞死愈重，是反映心肌損傷的特異性和敏感性均較高的指標(biāo)[6，7]。本研究結(jié)果顯示，H／R組上清液CK－MB、cTn－I含量以及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均較C組明顯升高，表明心肌細(xì)胞H／R損傷模型制備成功。

從結(jié)果可以看出，SFI組上清液CK－MB、cTn－I含量以及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均較H／R組顯著下降，表明SFI可通過(guò)減少CK－MB和cTn－I的釋放，抑制心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)H／R損傷心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。心肌細(xì)胞H／R損傷發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為主要通過(guò)黃嘌呤氧化酶途徑產(chǎn)生大量氧自由基聚集，介導(dǎo)膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使細(xì)胞膜流動(dòng)性和通透性增加，完整性喪失，膜對(duì)離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙，Na＋、K＋、Ca2＋等離子在細(xì)胞膜內(nèi)外分布異常致心肌細(xì)胞嚴(yán)重腫脹，線粒體功能受損，氧利用率降低。大量Ca2＋涌入細(xì)胞導(dǎo)致Ca2＋超載，通過(guò)加速黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，促使氧自由基增多，進(jìn)一步加重再灌注損傷[8，9]。MDA是氧自由基致脂質(zhì)過(guò)氧化的中間代謝產(chǎn)物，可反映細(xì)胞機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，間接反映細(xì)胞受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度，SOD可清除機(jī)體內(nèi)超氧自由基，保護(hù)細(xì)胞，因而SOD高低可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力[10，11]。本研究結(jié)果顯示，H／R可引起心肌細(xì)胞 MDA水平明顯上升而SOD活性明顯下降（P＜0.01），SFI則能顯著抑制H／R所致的MDA水平上升和SOD活性下降（P＜0.01），說(shuō)明SFI是通過(guò)減少氧自由基產(chǎn)生，抑制機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，從而對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。本研究中SFI選用了兩組濃度，結(jié)果顯示增加SFI濃度后心肌保護(hù)作用的增強(qiáng)并不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，SFI能顯著降低原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞CK－MB、cTn－I含量，抑制心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌H／R損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，其機(jī)制可能與提高心肌細(xì)胞SOD活性，減少M(fèi)DA生成量，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有關(guān)。

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