血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的表達在原發(fā)性肝細胞癌中的診斷價值

姜勝瑩，曹建彪，范公忍

原發(fā)性肝細胞癌(hepatocelluar carcinoma，HCC)是臨床常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率均較高［1-2］，對其早發(fā)現(xiàn)、早診斷以及早治療具有重要意義。研究證實，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3，GPC-3)與原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展以及診療密切相關［3-5］，其診斷敏感性和特異度較甲胎蛋白(alpha-Fetoproteins，AFP)均有增高，被認為是一種新型重要的HCC腫瘤標記物［6-7］，二者聯(lián)合檢測可提高HCC早期診斷率［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，GPC-3與HCC的分化程度及轉(zhuǎn)移復發(fā)有關［9］，也有研究表明GPC-3表達與腫瘤病理分級和臨床分期有關［10］，本文旨在探討GPC-3對HCC的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年1月—2012年7月北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍肝病治療中心住院的HCC 59例為HCC組，均符合2011年版《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》中診斷標準，并經(jīng)病理學、影像學確診，入院前未接受放療、化療、免疫治療或中藥治療等。男51例，女8例;年齡36～79歲。選擇同期該院確診的肝硬化住院患者35例為肝硬化組，均符合2000年中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會修訂的《病毒性肝炎防治方案》標準，男26例，女9例;年齡30～76歲;肝功能分級均與HCC組在同一水平。選擇同期該院健康體檢中心體檢者30例為健康對照組，男17例，女13例;年齡27～66歲;經(jīng)檢查各型肝炎病毒標志物及AFP均為陰性，無心、肝、肺、腎功能異常。3組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 材料與方法 受檢者在入院后均清晨空腹采集靜脈血3 ml，不抗凝，1000 r/min離心5 min，留取血清轉(zhuǎn)移至另一清潔的EP管內(nèi)放置于－70℃冰箱內(nèi)保存，統(tǒng)一檢測。血清GPC-3測定采用酶聯(lián)免疫定量法檢測，ELISA試劑盒購自美國R＆D公司(編號為DY2119)，計算平均光密度值(optical density，OD值)，通過使用計算機軟件產(chǎn)生四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合，從而創(chuàng)建GPC-3濃度的標準曲線，根據(jù)OD值計算每個樣品中GPC-3的含量;AFP檢測采用電化學發(fā)光免疫法測定，使用同型配套試劑，檢測值＞200 ng/ml者為陽性，各項操作均按照試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，成組資料組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率(%)表示，采用Pearson χ2檢驗，影響因素采用Logistic回歸模型分析，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 GPC-3濃度標準曲線 以GPC-3標準品連續(xù)2倍逐級稀釋濃度為橫坐標，以光密度結果檢測值為縱坐標，繪制標準曲線，直線回歸方程為:Y=0.0003X －0.0014，相關系數(shù) r≈1，見圖1。

圖1 酶聯(lián)免疫定量法檢測血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3濃度標準曲線

2.2 血清中GPC-3和AFP濃度檢測 HCC組血清GPC-3表達水平和AFP含量均明顯高于肝硬化組及健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，肝硬化組血清GPC-3表達水平和AFP含量與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 3組血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、甲胎蛋白濃度檢測結果(±s)

表1 3組血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、甲胎蛋白濃度檢測結果(±s)

注:與肝硬化組及健康對照組比較，aP＜0.05

組別 例數(shù) 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(pg/ml)甲胎蛋白(ng/ml)原發(fā)性肝細胞肝癌組 59 938.00 ±404.67a285.64 ±452.39a肝硬化組 35 338.00 ±238.00 4.54 ±5.39健康對照組30 304.67 ±204.67 1.97 ±1.52

2.3 血清GPC-3濃度檢測的ROC曲線 根據(jù)上述3組人群GPC-3檢測結果繪制特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)，見圖 2。曲線下面積為0.912，95%可信區(qū)間為0.859～0.965，當取GPC-3為601.33 pg/ml是判斷HCC的界值時，GPC-3診斷 HCC的敏感性為89.3%，特異度為90.8%，陽性預測值為 89.3%，陰性預測值為86.8%。以200 ng/ml為 AFP陽性界值，HCC組AFP陽性率為32.2%(19/59)，以601.33 pg/ml為GPC-3陽性界值，HCC組GPC-3陽性率為84.7%(50/59)。AFP與GPC-3聯(lián)合檢測可使HCC的確診率提高至88.1%(52/59)。

圖2 血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3濃度檢測的ROC曲線

2.4 HCC組GPC-3表達與AFP水平及臨床參數(shù)的Logistic回歸模型分析 對HCC組血清中GPC-3表達水平為因變量(Y=1，GPC-3＞601.33 pg/ml;Y=2，GPC-3≤601.33 pg/ml)，以年齡、性別、有無門脈癌栓、有無遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期、Child-pugh分級、有無HBsAg感染、AFP水平、腫瘤最大直徑為自變量，進行Logistic回歸模型分析，結果顯示GPC-3表達與年齡、性別、有無門脈癌栓、TNM分期、Child-pugh分級、有無HBsAg感染、AFP水平及腫瘤最大直徑均無相關性(P＞0.05)，而僅與有無遠處轉(zhuǎn)移有高度相關性(P＜0.05)，見表2。

表2 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3表達與甲胎蛋白水平和臨床參數(shù)Logistic回歸模型分析

3 討論

GPC-3屬于膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)超家族成員，主要通過糖基(GPI)錨定于細胞膜上［11］，GPC-3基因位于人類的X染色體(Xq26)上，全長大約900 kb，其編碼的含580個氨基酸的核心蛋白質(zhì)前體可裂解生成1個40 kDa氨基(N)端蛋白和1個30 kDa膜結合羧基(C)終端蛋白，2個硫酸乙酰肝素(HS)糖鏈連接到C-末端，參與信號間的傳遞［12］，通過多種信號通路直接調(diào)控腫瘤細胞增殖、分化、黏附及轉(zhuǎn)移等過程［13-15］，尤其在HCC組織中發(fā)揮了重要作用［16-17］，GPC-3在核心蛋白下游富含半胱氨酸結構區(qū)的下端，即第358位精氨酸和359位絲氨酸處可以被酶切割而分成2段，使N-端約含40 kDa的GPC-3蛋白成為可溶性蛋白片段而分泌入血，這是外周循環(huán)血清能夠檢測GPC-3的分子生物學基礎。

本研究采用酶聯(lián)免疫定量法檢測GPC-3標準品濃度，結果顯示，本實驗的標準曲線近似直線，相關系數(shù)接近1，說明曲線擬合度較好，實驗結果具有較好的重復性。同時檢測了59例HCC、35例肝硬化及30例健康體檢者中 GPC-3表達水平，發(fā)現(xiàn)HCC組血清GPC-3呈現(xiàn)高表達，而在肝硬化組及健康對照組呈現(xiàn)低表達甚至無表達。本研究采用ROC曲線法，標定GPC-3為601.33 pg/ml是診斷HCC的陽性界值，敏感性為 89.3%，特異度為90.8%，陽性預測值為 89.3%，陰性預測值為86.8%;HCC組AFP陽性率為32.2%，GPC-3陽性率為84.7%，AFP與GPC-3聯(lián)合檢測可使HCC確診率提高至88.1%。研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者血清GPC-3濃度明顯高于肝炎后肝硬化、慢性肝炎等肝臟良性病變患者及健康對照組［18-20］。江楓等［21］應用ELISA檢測計算發(fā)現(xiàn)當以3.19 μg/ml為診斷界值時，GPC-3診斷HCC的敏感性和特異度分別為85.4%及98.9%，進一步發(fā)現(xiàn)，GPC-3能顯著提高小肝癌與肝硬化結節(jié)的鑒別診斷。吳詩品等［22］研究顯示HCC組血清GPC-3濃度明顯高于肝內(nèi)良性占位組和正常對照組，根據(jù) ROC曲線，取412.6 pg/ml為診斷界值時，GPC-3診斷HCC的敏感性和特異度分別為63.2%和89.3%。付順軍等［23］研究結果顯示，HCC患者血清中 GPC-3濃度明顯高于肝硬化患者和健康者，而肝硬化患者和健康者比較差異無統(tǒng)計學意義，診斷HCC的敏感性和特異度分別為88.1%和85.9%。Zhang等［24］利用磁粒子為基礎的酶聯(lián)免疫化學發(fā)光技術(CLEIA)測定正常肝臟、肝硬化、繼發(fā)性肝癌及原發(fā)性肝癌患者血清中GPC-3的濃度，發(fā)現(xiàn)GPC-3在原發(fā)性肝癌患者的血清中高表達，而在正常成人、肝炎、肝硬化中無表達或低表達，可有效的診斷原發(fā)性肝癌，是HCC的一個重要且有效的腫瘤標記物。因此我們認為GPC-3有可能成為替代AFP，或更有價值的肝癌標志物分子。

本研究進一步結合臨床參數(shù)進行Logistic回歸模型分析后發(fā)現(xiàn)，GPC-3表達僅與有無遠處轉(zhuǎn)移呈高度相關，而有無遠處轉(zhuǎn)移和HCC的預后密切相關，因此我們推測GPC-3的高表達在某種程度上與HCC預后相關。Yao等［25］研究發(fā)現(xiàn)HCC患者血清中AFP及GPC-3蛋白分布量不具有相關性，本研究結果與該文獻報道一致。王攀等［26］研究顯示，血清中GPC-3和AFP的表達均與HCC的臨床分期、病理分級、肝硬化程度有關。也有研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者GPC-3 mRNA的表達與血清AFP水平、門脈癌栓、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、HBsAg及年齡等不相關，而與腫瘤直徑有關［27］。不同學者得出不同結論，GPC-3的表達與HCC預后的關系尚無明確結論，期待更多相關研究進一步證實。

綜上所述，GPC-3在HCC診斷中有較高的敏感性和特異度，尤其是在AFP陰性的HCC中，可成為診斷HCC重要的腫瘤標志物之一，其表達與HCC有無遠處轉(zhuǎn)移有關，由于本文觀察例數(shù)較少，有關機制和實驗結論尚需進一步深入研究。

［1］成薇婷，田德英.原發(fā)性肝細胞癌組織Shh和Ptch-1與GLI-2表達及生物學意義的研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2009，16(3):200-203.

［2］崔連鷙，于秀艷.300例原發(fā)性肝癌乙肝兩對半及抗-HCV檢測結果分析［J］.中國實驗診斷學，2012(2):315-316.

［3］Lin C W，Mars W M，Paranjpe S.Hepatocyte proliferation and hepatomegaly induced by phenobarbital and 1，4-bis［2-(3，5-dichloropyridyloxy)］benzene is suppressed in hepatocyte-targeted Glypican-3 transgenic mice［J］.Hepatology，2011，54(2):620-630.

［4］Ho M，Kim H.Glypican-3:a new target for cancer immunotherapy［J］.Eur J Cancer，2011，47(3):333-338.

［5］余彬彬，曹驥，歐超，等.肝癌組織GPC-3mRNA和IGFⅡmRNA表達及其臨床意義的研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2008，15(15):1159-1162.

［6］Tangkijvanich P，Chanmee T，Komtong S.Diagnostic role of serum glypican-3 in differentiating hepatocellular carcinoma from non-malignant chronic liver disease and other liver cancers［J］.J Gastroenterol Hepatol，2010，25(1):129-137.

［7］Wang H L，Anatelli F，Zhai Q J，et al.Glypican-3 as a useful diagnostic marker that distinguishes hepatocellular carcinoma from benign hepatocellular mass lesions［J］.Arch Pathol Lab Med，2008，132(11):1723-1728.

［8］于璐，范方淑，張曦，等.GPC-3與AFP在肝硬化異型增生結節(jié)及肝細胞癌中的表達及意義［J］.昆明醫(yī)學院學報，2011(10):32-35.

［9］Ning S，Bin C，Na H.Glypican-3，a novel prognostic marker of hepatocellular cancer，is related with postoperative metastasis and recurrence in hepatocellular cancer patients［J］.Mol Biol Rep，2012，39(1):351-357.

［10］宋孟锜，楊永飛，王冬冬，等.磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3和甲胎蛋白聯(lián)合檢測對原發(fā)性肝癌的診斷價值［J］.臨床肝膽病雜志，2011，27(4):391-393，399.

［11］Zhang L，Liu H，Sun L，et al.Glypican-3 as a potential differential diagnosis marker for hepatocellular carcinoma:a tissue microarray-based study［J］.Acta Histochem，2012，114(6):547-552.

［12］Ho M.Advances in liver cancer antibody therapies:a focus on Glypican-3 and mesothelin［J］.BioDrugs，2011，25(5):275-284.

［13］康凱夫，張艷麗.DLK1和GPC-3在不同肝組織的表達及其臨床意義［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2011，21(28):3499-3502.

［14］卞銀珠，姚登福.GPC-3異常表達、信號通路及肝癌的靶向治療［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2011，20(1):11-14.

［15］Liu S，Li Y，Chen W，Zheng P，et al.Silencing Glypican-3 expression induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，419(4):656-661.

［16］Nobuoka D，Motomura Y，Shirakawa H，et al.Radiofrequency ablation for hepatocellular carcinoma induces glypican-3 peptide-specific cytotoxic T lymphocytes［J］.Int J Oncol，2012，40(1):63-70.

［17］吳飛翔，黃山，馬良，等.肝癌細胞中與Glypican-3相關的信號轉(zhuǎn)導分子表達分析［J］.中國腫瘤，2011，20(7):521-524.

［18］Wang F H，Yip Y C，Zhang M.Diagnostic utility of Glypican-3 for hepatocellular carcinoma on liver needle biopsy［J］.J Clin Pathol，2010，63(7):599-603.

［19］Yasuda E，Kumada T，Toyoda H，et al.Evaluation for clinical utility of GPC-3，measured by a commercially available ELISA kit with Glypican-3(GPC-3)antibody，as a serological and histological marker for hepatocellular carcinoma［J］.Hepatol Res，2010，40(5):477-485.

［20］劉斐燁，蘇寧，梁繼珍，等.Glypican-3蛋白在肝癌患者血清中的表達及意義［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(1):55-56.

［21］江楓，肖明兵，倪潤洲，等.血清Glypican-3 ELISA檢測法的建立及初步應用［J］.臨床檢驗雜志，2011，29(4):244-246.

［22］吳詩品，劉真真，楊智.外周血磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3檢測在原發(fā)性肝癌診斷中的意義［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2011，20(21):3271-3274.

［23］付順軍，李紹強，林杰，等.Glypican-3在原發(fā)性肝細胞癌中的表達及其對預后的影響［J］.中國病理生理雜志，2010，26(12):2351-2357.

［24］Zhang Q Y，Chen H，Lin Z，et al.Chemiluminescence enzyme immunoassay based on magnetic nanoparticles for detection of hepatoceUular carcinoma marker Glypican-3［J］.Journal of Pharmaceutical Analysis，2011，1(3):166-174.

［25］Yao M，Yao D F，Bian Y Z.Oncofetal antigen Glypican-3 as a promising early diagnostic marker for hepatocellular carcinoma［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2011，10(3):289-294.

［26］王攀，鄭志保，李招云，等.熒光定量RT-PCR檢測肝細胞癌患者GPC3 mRNA和AFP mRNA的診斷價值［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011，21(6):1448-1450.

［27］Sun C K，Chua M S，He J.Suppression of Glypican-3 Inhibits Growth of Hepatocellular Carcinoma Cells through Up-Regulation of TGF-beta2［J］.Neoplasia，2011，13(8):735-747.