裂谷熱假病毒顆粒研制及鑒定

鄧俊花 林祥梅 張永寧 馮春燕 王彩霞 吳紹強

裂谷熱（Rift valley fever，RVF）是由蚊子作為傳染媒介的病毒性傳染病，主要感染反芻動物，如綿羊、山羊和牛，可引起懷孕動物流產(chǎn)和幼小動物死亡［1］。在疫病流行期間，也會引起人類發(fā)病。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定上報的A類動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。歷史上，裂谷熱主要在非洲撒哈拉以南地區(qū)流行，2000年8月向北蔓延到亞洲的阿拉伯半島（也門和沙特阿拉伯），對我國構(gòu)成了嚴(yán)重威脅［2］。

為了有效監(jiān)控并防止裂谷熱疫情的傳播，Sall等［3，4］建立了裂谷熱的巢式RT-PCR檢測方法，并在肯尼亞（1998年）及南非（1999年）的兩次疫情診斷中發(fā)揮了重大作用。Drosten等［5，6］建立了裂谷熱一步法實時定量RT-PCR檢測方法。但由于安全有效陽性質(zhì)控物質(zhì)的缺乏，導(dǎo)致上述檢測技術(shù)難以在非疫區(qū)推廣應(yīng)用。近幾年，Pasloske等［7，8］提出了一種新的RNA質(zhì)控品制備技術(shù)，即裝甲RNA（Armored RNA）技術(shù)，利用該技術(shù)制備的假病毒顆粒穩(wěn)定、安全，并能有效監(jiān)控RNA樣品核酸制備及RT-PCR反應(yīng)的全過程。病毒樣顆粒（Virus like particle，VLP）是含有某種病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，不含病毒核酸，不能自主復(fù)制，但可以組裝成顆粒樣結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)和抗原表位與天然的病毒顆粒十分相似，具有較強的免疫原性及較好的安全性。在體外通過特殊方法將病毒樣顆粒與重組質(zhì)粒DNA（如基因疫苗）融合，轉(zhuǎn)錄成的重組RNA包入病毒樣顆粒內(nèi)，即形成假病毒（pseudovirus）。

RVFV屬布尼亞病毒科白嶺病毒屬（phlebovinzs）RNA病毒，具包膜，核酸共分L、M和S 3個節(jié)段，L節(jié)段編碼RNA多聚酶，M節(jié)段編碼病毒包膜蛋白，均為負(fù)鏈RNA。S節(jié)段編碼核蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，部分為負(fù)鏈，其他部分為正鏈，即呈所謂雙義（ambisense）結(jié)構(gòu)。補體結(jié)合反應(yīng)抗原同部分S節(jié)段編碼的N蛋白相關(guān)。

本研究針對裂谷熱病毒中比較保守的S基因設(shè)計引物和探針，研制裂谷熱假病毒顆粒，并進(jìn)一步借助熒光RT-PCR方法進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

MS2-T質(zhì)粒，是包含MS2第12-1796位的T載體重組質(zhì)粒，由華大吉比愛生物技術(shù)有限公司陳唯軍教授惠贈。pGEM-T-RVF質(zhì)粒，是包含RVFV S基因第12-576位的T載體重組質(zhì)粒，由本實驗室構(gòu)建、保存。pTrcHis2A載體購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank上裂谷熱病毒S基因序列（GenBank登錄號DQ380149）設(shè)計了熒光RT-PCR引物rvfv-u1/L1和探針rvfv-p1［9］，同時設(shè)計了2套PCR引物RVF-F/R（分別引入酶切位點Pst I和Hind Ⅲ）和Vector-F/R。引物序列見表1。

表1 所用基因的引物及探針序列

1.2.2 p-MS2假病毒載體構(gòu)建 MS2-T質(zhì)粒和表達(dá)載體pTrcHis2A分別進(jìn)行Nco I和Bgl II雙酶切，酶切體系為 ：Nco I/Bgl II 1μL，10×K buffer 2μL，0.1％BSA 2μL，模板 1μg，補水至 20μL，37℃ 2h。酶切產(chǎn)物分別命名為pTrcHis2A（N/B）和MS2-T（N/B）。分別將酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，用T4 DNA連接酶連接，連接體系為：10× buffer 1μL，T4 酶 5 U，pTrcHis2A（N/B）50ng，MS2-T（N/B）150ng，25℃，10min，然后立即放冰上。將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取單克隆搖菌，以Vector-F/R為引物對菌液進(jìn)行PCR鑒定。將PCR鑒定為陽性的克隆抽提質(zhì)粒，送北京諾賽基因組研究中心測序。測序正確的菌株命名為p-MS2，于-86℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 p-MS2-RVF重組質(zhì)粒構(gòu)建 pGEM-T-RVF質(zhì)粒與p-MS2質(zhì)粒分別進(jìn)行Pst I和Hind Ⅲ雙酶切。將酶切產(chǎn)物回收純化，用T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，分別以RVF-F/R、Vector-F/R為引物進(jìn)行PCR鑒定，測序。測序正確菌株命名為p-MS2-RVF，于-86℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 p-MS2-RVF假病毒顆粒純化及特性鑒定

1.2.4.1 假病毒顆粒的表達(dá)與初步純化 p-MS2-RVF重組菌加入1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)16h，離心，菌體沉淀用1×TE buffer混勻，按1 1000加入溶菌酶（25mg/mL），37℃裂解處理30min，4℃，12000r/min離心15min，上清即為含假病毒顆粒的表達(dá)產(chǎn)物。按表達(dá)產(chǎn)物∶酶量=125 1 1分別加入RNaseA（1mg/mL）和DNase I（1mg/mL）37℃消化1h。消化產(chǎn)物依次經(jīng)過鹽沉淀、氯仿作用后，得到粗純的假病毒顆粒溶液。參照文獻(xiàn)［10］。

1.2.4.2 假病毒顆粒的純化 在超速離心管中制備蔗糖密度梯度溶液，加入含假病毒顆粒的溶液，最后 用 SM（0.1mol/L NaCl，8mmol/L MgSO4·7H2O，50mmol/L Tris-Cl pH7.5，2％明膠溶液）溶液補滿。分級梯度于4℃，40000r/min，離心12h?；厥蘸俨《绢w粒的區(qū)域，再超速離心，去上清，加入適量SM溶液，重懸沉淀，進(jìn)行PCR與RT-PCR鑒定純化效果。

1.2.5 假病毒顆粒特性鑒定 敏感性試驗：將50μL/管純化的假病毒顆粒溶液分別放置于56℃（1d）、37℃（20d）、 常溫（30d）、 4℃（30d）、 -20℃（60 d），每種條件下5份樣本，每份樣本各取10μL混勻，進(jìn)行樣品處理后RT-PCR鑒定。RNase A攻擊試驗：在50μL假病毒顆粒溶液中分別加入RNase A（1mg/mL）1-4μL后，37℃放置 30min，對照組不加RNase A，每種條件下5份樣本，每份樣本各取10μL混勻，RNA抽提后進(jìn)行RT-PCR鑒定。電鏡觀察：純化的假病毒顆粒溶液經(jīng)1％醋酸雙氧鈾負(fù)染后，利用透射電鏡（JEM-1400）進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.2.6 裂谷熱假病毒顆粒熒光RT-PCR方法鑒定

將裂谷熱假病毒顆粒溶液進(jìn)行10倍系列稀釋，采用Trizol（Invitrogen，USA）試劑分別提取RNA，對應(yīng)4.25×108-4.25×102copies/mL，裂谷熱熒光RT-PCR檢測體系如下：10×PCR Buffer（Mg2+）2.5μL，MgCl2（2.5mmol/L）5.0μL，d NTP（各 2.5mmol/L）2.5μL，rTaq DNA Polymerase 2.5 U，AMV-XL 2.5 U，RNase Inhibitor 20 U，Rvfv-u1/L1（10μmol/L）10 pmol/10 pmol，Rvfv-p1（10μmol/L）10 pmol， 模 板 RNA 10ng。RT-PCR反應(yīng)程序：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，47℃退火30s，擴增40個循環(huán)，每個循環(huán)反應(yīng)結(jié)束時收集熒光信號。

2 結(jié)果

2.1 p-MS2質(zhì)粒測序結(jié)果

p-MS2質(zhì)粒經(jīng)測序，MS2目的片段完全正確插入載體pTrcHis2A中。

2.2 p-MS2-RVF菌液PCR鑒定及測序結(jié)果

以p-MS2-RVF菌液為模板，分別以RVF-F/R，Vector-F/R為引物進(jìn)行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳（圖1）顯示，目的條帶分別在500-700bp、2000-3000bp之間，與預(yù)設(shè)計的目的基因片段大?。?84bp和2 479bp）相符。經(jīng)測序RVFV目的片段已正確插入至載體p-MS2中。

2.3 假病毒顆粒純化效果鑒定

純化產(chǎn)物作為RT-PCR反應(yīng)模板，其中一組不經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄直接進(jìn)行PCR鑒定，檢測結(jié)果為陰性，表明制備的假病毒顆粒溶液中無DNA污染。另一組樣本進(jìn)行RT-PCR鑒定，檢測結(jié)果呈陽性，表明裂谷熱基因片段已經(jīng)重組于假病毒顆粒中，而且模板以RNA形式存在（圖2）。

圖1 裂谷熱p-MS2-RVF菌液PCR鑒定

圖2 假病毒顆粒純化效果

2.4 純化后的假病毒顆粒溫度敏感試驗

經(jīng)試驗，假病毒顆粒溶液在37℃情況下至少可以保存20d，隨著保存溫度降低，保存時間越長。由此可以看出，該假病毒顆粒具有良好的穩(wěn)定性（圖 3）。

圖3 假病毒顆粒溫度敏感性檢測結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗（RNase A攻擊試驗）

用RNaseA處理的假病毒顆粒溶液與對照組樣品分別進(jìn)行RT-PCR鑒定，檢測結(jié)果一致，表明制備的假病毒顆粒溶液可抵抗RNaseA的降解（圖4）。

2.6 電鏡觀察

超聲破碎表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SYBR Green染色后通過蔗糖密度梯度離心，可以看到在密度為35％區(qū)域內(nèi)有綠色熒光條帶出現(xiàn)。利用透射電鏡對假病毒顆粒純化樣品進(jìn)行觀察圖5，可以看到直徑大約為26nm的多邊形顆粒，即誘導(dǎo)表達(dá)的假病毒顆粒。

圖4 假病毒顆粒穩(wěn)定性檢測結(jié)果

圖5 假病毒顆粒的電鏡觀察結(jié)果

2.7 假病毒顆粒熒光RT-PCR鑒定及其敏感性檢測

如圖6所示，隨著稀釋倍數(shù)的增加，Ct值逐漸增加。經(jīng)多次試驗表明，本方法對裂谷熱假病毒顆粒溶液最低檢測可達(dá)4.25×102copies。

圖6 不同稀釋濃度假病毒顆粒溶液與熒光信號Ct值關(guān)系圖

3 討論

早期MS2噬菌體的研究發(fā)現(xiàn)，在復(fù)制酶5'端存在一個由19個堿基組成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（發(fā)夾結(jié)構(gòu)），堿基序列為5'-ACAUGAGGAUUACCCAUGU-3'，是包膜蛋白二聚體與RNA相互作用的部位，這種相互作用形成的復(fù)合物是噬菌體自我包裝的信號，在復(fù)合物的基礎(chǔ)上，成熟酶蛋白與其他包膜蛋白分子結(jié)合并在自由能的驅(qū)動下形成相應(yīng)的空間構(gòu)象，完成MS2噬菌體的組裝［8，11-17］。本研究在該結(jié)構(gòu)相應(yīng)的基因序列下游插入了外源基因RVFV的S基因片段，借助載體上的轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子進(jìn)行基因調(diào)節(jié)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過菌裂解，雙酶（DNase I和RNase A）消化，梯度離心等處理，獲得含有RVFV外源基因的假病毒顆粒。

研究表明沒有成熟酶蛋白的VLPs，其內(nèi)包裝的 RNA 易被 RNase降解［18，19］。另外，在成熟酶蛋白的基因上存在一個與包裝位點相似的一致性序列［20］，有研究［21］認(rèn)為這個類包裝位點的存在使MS2的包膜蛋白在包裝時出現(xiàn)了協(xié)同效應(yīng)，這種協(xié)同效應(yīng)可以使RNA在低濃度的時候就可以引起包裝，增加了包裝的效率。另外，成熟酶蛋白有兩個位點與RNA相互作用［22］，這使得MS2包膜蛋白的包裝更容易進(jìn)行。本研究通過對制備的假病毒顆粒先后進(jìn)行溫度敏感試驗、RNase A攻擊試驗數(shù)據(jù)表明，此假病毒顆粒具有耐RNase的特性，穩(wěn)定性良好，在室溫可以保存至少30d，4℃可以保存更長時間，從而解決了RNA質(zhì)控品使用、保存和運輸?shù)姆€(wěn)定性問題。

在大腸桿菌中表達(dá)的假病毒顆粒主要存在于裂解物的上清中，由于在裂解過程中，大量復(fù)制的質(zhì)粒DNA也同樣隨病毒樣顆粒進(jìn)入上清中，如果加入DNase I的比例不當(dāng)，很難將質(zhì)粒DNA完全降解。本研究通過摸索，優(yōu)化表達(dá)產(chǎn)物和酶加入的比例，純化的假病毒顆粒溶液先進(jìn)行純度鑒定，提取的RNA直接進(jìn)行PCR鑒定，呈陰性，表明此溶液中無DNA污染；另一組RNA先反轉(zhuǎn)錄再進(jìn)行PCR鑒定，呈陽性，則表明此病毒顆粒中包含有RVFV外源基因。進(jìn)一步以假病毒顆粒提取的RNA為材料，進(jìn)行熒光Real-time RT-PCR方法鑒定，該方法中裂谷熱假病毒顆粒溶液最低檢測限可達(dá)4.25×102copies。

4 結(jié)論

在國內(nèi)外首次構(gòu)建了包裹裂谷熱病毒S基因片段 RNA的假病毒顆粒，穩(wěn)定性良好，具有耐RNase的特性，安全無污染，易運輸。研制的裂谷熱假病毒顆粒，憑借熒光RT-PCR方法最低可達(dá)到4.25×102copies檢測限，可作為參比物質(zhì)應(yīng)用于裂谷熱臨床分子生物學(xué)檢測方法。

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