奶牛體細胞核移植胚胎產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)條件優(yōu)化

孫偉 巴特爾 郭繼彤 李榮鳳 王建國 李明胡樹香 王春生 李喜和，3

到目前為止，綿羊［1］、山羊［2］、牛［3］、豬［4］、小鼠［5］、］馬〔6〕、駱駝［7］及馬鹿［8］等多種動物通過體細胞核移植技術獲得了健康成活的后代。體細胞克隆技術是利用供體動物細胞的DNA作為基因表達的模板，可以使克隆后代與供體動物的遺傳性狀完全相同，從而使動物品種的優(yōu)良性狀得以復制，所利用該技術進行良種動物遺傳資源的擴繁產(chǎn)業(yè)前景廣闊。

伴隨著國內(nèi)乳品企業(yè)規(guī)模的迅速擴張，對抗病力強、生產(chǎn)性能優(yōu)秀的高產(chǎn)奶牛的遺傳資源需求量增加，同時由于美加系高產(chǎn)活體奶牛進口的限制，只有通過引進高產(chǎn)奶牛細胞系，利用體細胞克隆技術與胚胎移植技術結(jié)合是實現(xiàn)高產(chǎn)奶牛快速擴繁的捷徑，達到高效組建高產(chǎn)奶牛核心群的目的。目前，奶?？寺∨咛ブ貥嫶嬖诩夹g操作繁瑣，生產(chǎn)效率低等問題，要想實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，必須簡化操作程序，提高整體效率。本試驗擬對高產(chǎn)奶?？寺∨咛ドa(chǎn)關鍵環(huán)節(jié)進行系統(tǒng)優(yōu)化，以達到簡化操作程序和提高效率為目的，為獲得批量、高質(zhì)量的高產(chǎn)克隆奶牛后代奠定了技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑、儀器及配方 TCM199（Gibco，11150-059），F(xiàn)SH（Sigma，F(xiàn)8174），17-β-E2（Sigma，E8-875），F(xiàn)BS（Gibco，16000-036），Cytochalasin-B（Sigma，C6762），Hyaluronidase（Sigma，H4272），Sodium pyruvate（Sigma，P3662），D-Mannitol（Sigma，M9546），6-DMAP（Sigma，D2629），Ionomycin（Sigma，10634），Peni/Strep（100×）（Gibco，150-70），BSA（Austrilian，ICP/biologicals AVIVP-100G），99.999％混合三氣（5％CO2-5％O2-90％N2）（北京普萊克斯適用氣體有限公司）。

體視顯微鏡（NIKON，SMZ1500），顯微操作儀（日本NIKON，TE2000），細胞融合儀（澳大利亞公司生產(chǎn)，IP-1）。

成熟液組成 ：TCM199+10％ FBS+1μg/mL 17-β-E2+10mmol/L Hepes+0.12mg/mL Pyruvate+0.1mg/mL Strepolin+0.125mg/mL penicilla-mine+10μg/mL FSH）。

融合液組成：0.25mmol/L D-C6H14O6，0.5mmol/L Hepes，0.05mmol/L（C2H3O2）Mg·4H2O，0.01％BSA，0.1mmol/L Ca（C2H3O2）2。

發(fā)育液組成：107.7mmol/L NaCl，7.15mmol/L KCl，0.3mmol/L KH2PO4，25mmol/L NaHCO3，3.32mmol/L sodium lactate，0.04mmol/L kanamycinmonosulfate，0.33mmol/L pyruvate，1.71mmol/L CaCl2·2H2O，6mmol/L fatty-acid free bovine albumin，0.001mmol/Lheparin，0.2mmol/L penicillamine，0.1mmol/L Strepolin。

1.1.2 卵巢采集 卵巢采集于呼和浩特市郊區(qū)清真屠宰場。采集的卵巢保存于25-30℃滅菌生理鹽水保溫瓶中，在4h內(nèi)運至實驗室。

1.1.3 奶牛耳組織的采集 供體成纖維細胞采自旭日牧場620#高產(chǎn)奶牛（第1胎，3歲，產(chǎn)量12 t/年）和昭君牧場001#高產(chǎn)奶牛（第5胎，9歲，產(chǎn)量15 t/年）耳皮組織。

1.2 方法

1.2.1 卵母細胞的采集 在無菌條件下用滅菌生理鹽水沖洗卵巢3-5次，常規(guī)16號針頭的10mL注射器先吸少量PBS溶液，抽吸卵巢表面2-6mm卵泡，將抽吸的卵泡液注入15mL的離心管中，在37℃水浴鍋中靜置10min，然后在體視顯微鏡下?lián)炻?。選擇A、B級卵丘卵母細胞復合體（COCS）進行成熟培養(yǎng)。

1.2.2 卵母細胞的體外成熟 將A、B級COCs在成熟液中洗滌3遍，移入預先在CO2培養(yǎng)箱中平衡好的含有成熟液的4孔板中。每個孔中80-100枚COCs，放入培養(yǎng)條件為38.5℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行成熟培養(yǎng)。成熟培養(yǎng)17h后把卵母細胞移入含0.25％透明質(zhì)酸酶的H-M199中作用3-5min，用200μL的移液器輕輕反復吹吸去除卵球細胞，然后用含10％FBS的TCM199清洗卵母細胞。在顯微鏡下檢查成熟情況，以排出第一極體為成熟的標志，用于克隆胚胎重構。

1.2.3 成纖維細胞系的建立和核移植前準備 將耳部皮膚組織塊放入含40μg/mL慶大霉素的PBS緩沖液中，帶回實驗室在超凈臺中洗滌和清理后，用眼科剪切成1mm3大小的組織塊，接種在細胞培養(yǎng)瓶。倒置培養(yǎng)瓶后在培養(yǎng)箱內(nèi)靜置4h，然后加入5mL含10％FBS的DMEM/F12的培養(yǎng)液，放入37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)10-12d，每3d換一次新鮮培養(yǎng)液。成纖維細胞匯合并鋪滿瓶底，這時可傳代進行純化。根據(jù)上皮細胞與成纖維細胞對酶消化敏感性不同及二者貼壁速度的差異，可將二者分離純化。在混合生長的原代或傳代細胞培養(yǎng)中，吸掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入無血清DMEM/F12清洗，再用1.5mL胰蛋白酶（TE）消化液覆蓋細胞，37℃消化3-5min。在倒置顯微鏡下觀察細胞回縮時立即加入10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液3mL終止細胞消化，然后用移液器吹打分離懸浮細胞并在1500r/min條件下離心5min，加入培養(yǎng)液把細胞的密度調(diào)整到（5-10）×104個/mL，再接種培養(yǎng)，通過2-3 次選擇傳代，可完全純化成纖維細胞與上皮樣細胞，建立成纖維細胞系。

供體成纖維細胞采用兩種處理方法。血清饑餓法是當細胞長到70％-80％匯合時，用含0.5％ FBS的DMEM/F12饑餓處理3d后，胰酶消化成單細胞懸液待用。非血清饑餓法是細胞長到70％-80％匯合時，直接利用胰酶消化獲得細胞懸液，離心后用含HEPES的操作液50μL懸浮細胞并置于4℃保存用于移核。

1.2.4 體細胞核移植 采用盲吸法和熒光染色輔助兩種方法去核。盲吸法是先用7.5μg/mL CB液處理卵母細胞5min，然后用TCM-199清洗3遍置于覆蓋石蠟油的10％FBS的H-M199的操作滴中，同時加入供體細胞。在顯微操作系統(tǒng)下，用持卵針吸住卵母細胞，去核針插入卵內(nèi)吸去第一極體及其附近少量胞質(zhì)，將供體成纖維細胞直接注射到去核卵母細胞透明帶下，并用針輕輕觸壓使供體細胞與細胞膜緊密接觸。熒光染色輔助去核法是用10μg/mL Hoechst 33342染色處理卵母細胞5min，然后置于操作滴中在UV的照射下，卵母細胞的細胞核被激發(fā)熒光，可用去核針徹底吸除細胞核物質(zhì)，再把供體細胞注入卵母細胞透明帶下進行卵子的重構。

1.2.5 重構胚胎融合 細胞核移植后的重構胚胎置于融合液中平衡2min，然后轉(zhuǎn)入充滿融合液的融合槽（規(guī)格-0.5mm），用封閉的毛細管調(diào)整方向，使細胞接觸面與電極平行，設定電壓2.5 kV/cm，脈沖時間為20 μs。待融合完畢，用含10％ FBS的H-M199洗3遍，再置于成熟液中，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)15-20min后鏡檢融合情況。

1.2.6 克隆胚胎的激活與體外培養(yǎng) 將融合的重構胚胎用5μmol/L離子霉素處理5min、2mmol/L 6-DMAP聯(lián)合激活處理4h，然后將重構胚置于覆蓋石蠟油的SOFaa培養(yǎng)液的4孔板中培養(yǎng)，每孔放入30枚重構胚/0.5mL。培養(yǎng)氣相條件一種是置于38.5℃、5％CO2飽和濕度；另一種是38.5℃、5％CO2-5％O2-90％N2飽和濕度。48h后檢查卵裂情況，連續(xù)培養(yǎng)7d檢查囊胚發(fā)育情況。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 利用卡方檢驗對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。

2 結(jié)果

2.1 兩種去核方法對牛重構胚胎發(fā)育的影響

試驗結(jié)果見表1。熒光染色輔助和盲吸法兩種去核方式去核率（100％，92.44％）、融合率（57.09％，61.61％）、卵裂率（75.17％，76.81％）以及囊胚率（24.83％，28.26％）之間均無顯著差異（P＞0.05）。但是熒光染色法輔助去核增加了核移植的操作步驟，而且UV照射對克隆囊胚的后期發(fā)育及克隆動物產(chǎn)生的影響尚具有不確定性，故本研究認為采用盲吸法有利于重構胚胎的發(fā)育，簡化了操作程序，同時提高了效率（圖1）。

2.2 不同年齡供體牛細胞系對牛重構胚胎發(fā)育的影響

分別以第一胎620#高產(chǎn)奶牛成纖維細胞系A和高產(chǎn)第5胎001#成纖維細胞系B為供體進行核移植，比較這兩種不同年齡供體牛的細胞對核移植重構胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果見表2，成纖維細胞系A和成纖維細胞系B為供體的重構胚的融合率分別為61.95％、71.15％，卵裂率分別為81.43％、67.57％，囊胚發(fā)育率分別為31.43％、25.68％兩者之間均無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明供體牛的年齡對核移植后重構胚的融合以及發(fā)育的影響均不顯著，但以成纖維細胞A有一定的升高的趨勢（圖2）。

表1 不同去核方式對牛重構胚胎發(fā)育的影響

圖1 Hoechst 33342染色的MII卵母細胞（A）及Hoechst 33342染色的MII卵母細胞輔助去核（B）

表2 不同年齡牛的供體細胞對重構胚胎發(fā)育的影響

圖2 Hoechst 33342熒光染色的?？寺》趸遗撸ˋ）及發(fā)育7d的牛克隆囊胚（B）

2.3 供體細胞同期處理與否對牛重構胚胎發(fā)育的影響

用血清饑餓3d和未經(jīng)血清饑餓的牛耳成纖維細胞為供體細胞進行核移植重構克隆胚胎，比較供體細胞同期處理對克隆胚胎發(fā)育的影響結(jié)果，見表3。以血清饑餓3d的細胞和未經(jīng)血清饑餓的細胞為供體的重構胚融合率分別為74.63％、58.62％，卵裂率分別為71.33％、80.88％，囊胚發(fā)育率分別為24.00％、29.90％兩者之間均無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明供體細胞的血清饑餓與否對核移植后重構胚的融合以及發(fā)育的影響均不顯著，但就其卵裂率及囊胚率未饑餓處理組效果較好。

表3 供體細胞的血清饑餓處理對牛重構胚胎發(fā)育的影響

2.4 不同氣相組成條件對牛重構胚胎發(fā)育的影響

形態(tài)良好的重構胚分別在5％ CO2-5％O2-90％N2和5％CO2-AIR兩種氣相中進行發(fā)育培養(yǎng)，第2天記錄卵裂情況，第7天統(tǒng)計囊胚率。結(jié)果見表4，重構胚在5％CO2-5％O2-90％N2和5％CO2-AIR氣相中進行發(fā)育的卵裂率分別為82.35％、75.22％，囊胚發(fā)育率分別為31.55％、28.26％兩者之間均無顯著差異（P＞0.05）。兩種氣相組成對重構胚后期發(fā)育的影響差異并不顯著，但從試驗數(shù)據(jù)看5％CO2-5％O2-90％N2對牛重構胚的后期發(fā)育有一定的促進作用。

表4 體外培養(yǎng)不同氣相組成對牛重構胚胎發(fā)育的影響

3 討論

體細胞核移植受體卵母細胞去核是克隆胚胎構建的關鍵步驟。在?？寺∨咛サ臉嫿ㄟ^程中通常采用盲吸法和熒光染色進行去核處理。一般認為熒光染色去核是通過熒光染料（Hochest33342）染細胞核DNA后在UV紫外光照射下引導去核，操作時間比較長，不利于去核效率的提高，而且UV照射對克隆胚胎的發(fā)育也可能會產(chǎn)生不利的影響。而盲去核法操作效率高、避免了UV照射對后期克隆胚胎發(fā)育的負面影響，如果處理時卵子成熟的時間太長會降低去核效率。本研究為了準確把握極體與卵母細胞核的對應位置關系，達到盲吸準確去核的目的，控制卵母細胞成熟時間在17h內(nèi)。同時，在成熟培養(yǎng)前對卵母細胞進行了嚴格的篩選。試驗結(jié)果證明，成熟17h后多數(shù)卵子的極體剛排出，極體基本與核相毗鄰，隨著成熟時間的延長會出現(xiàn)第一極體與核相對位置的偏移，則不利于盲吸法去核。 因此，在進行?？寺∨咛ブ貥嫊r，選擇17h的卵母細胞成熟時間進行盲吸法去核，可以更有效地重構克隆胚胎。

目前，動物克隆存在孕期流產(chǎn)率與圍產(chǎn)期胎兒死亡率高，胎兒過度的發(fā)育和出生后生長發(fā)育異常等問題，推測其主要原因是在核移植重構克隆胚胎的發(fā)育過程中供體細胞核的不完全重編程［9］。細胞核重編程包括分化（differentiation）、去分化（dedifferentiation）以及轉(zhuǎn)分化（transdifferentiation）3個方面［10］。去核卵胞質(zhì)為已分化的供體細胞提供表觀遺傳修飾的環(huán)境，激活對胚胎早期發(fā)育是有重要作用的基因，并抑制與分化相關的基因的表達，使單個分化的細胞發(fā)育成一個正常的胚胎和個體。有關研究指出，可能由于供體細胞在細胞更新過程中，某些特定的基因會隨著個體的生長而出現(xiàn)選擇性的表達，因此選用“年齡大”的供體細胞，在重構胚發(fā)育過程中會受到供體細胞基因本身活性的影響，某些對胚胎發(fā)育至關重要的基因在個體發(fā)育生長過程中處于低活性時期，對供體細胞的重編程不利［11］。對于奶牛的克隆，目前供體細胞的來源主要通過采集產(chǎn)奶牛的耳皮組織或超排活體采卵獲得卵球細胞兩種現(xiàn)實可行的途徑。本試驗采集了年齡差異較大的奶牛耳皮組織建立成纖維細胞系，并利用這兩種細胞系構建了克隆胚胎，盡管在統(tǒng)計學上沒有顯著差異，但是利用年齡較小的成年牛細胞系為供體的囊胚發(fā)育率相對高些。是否是由于年齡的差異可能導致細胞的分化程度不同，以及對細胞重編程效率的差異還有待于進一步研究證實。

在動物克隆研究中，供體細胞的周期對克隆效率的影響眾說不一，普遍認為位于細胞周期的G0/G1期的二倍體細胞對于核移植中供體細胞的重編程是必需的。主要通過血清饑餓將細胞誘導至G0/G1期，世界首例體細胞克隆綿羊Dolly就是通過血清饑餓誘導供體細胞到G0/G1期獲得健康后代。Cibelli和 Vignon等［3，12］不經(jīng)饑餓同樣得到了克隆動物。本研究中貼壁培養(yǎng)的細胞經(jīng)過3-4d無血清饑餓，細胞的形態(tài)和大小發(fā)生了變化，經(jīng)血清饑餓的細胞在胰蛋白酶消化以后細胞的大小比較一致，但細胞在操作時細胞的膜的耐受性差易破膜，而且融合效果和胚胎發(fā)育率都不是很理想。由于第一次融合率低，導致重構的胚胎進行第二次融合，克隆胚胎在融合液中滯留的時間增長，可能影響了克隆胚胎后期的發(fā)育。也就是說，細胞同期化處理對于重構胚胎效率并沒有顯著作用。Beyhan 等［13］認為，長時間低血清濃度處理可能破壞核細胞內(nèi)DNA結(jié)構，影響核移植成功率。目前，由于S期細胞處于DNA合成階段，重構胚易形成2倍化和4倍化之間的非整倍體動物，而沒有克隆動物個體的報道以外，其它G1、G2和M期［14］的細胞都被證明可作為供體用于克隆研究。本研究認為細胞同期與否對克隆胚胎發(fā)育沒有顯著的影響，可以采用非血清饑餓的方法處理供體細胞進行克隆胚胎構建。

目前，多數(shù)實驗室用于培養(yǎng)?？寺∨咛サ臍庀鄺l件都是飽和濕度的培養(yǎng)箱中5％CO2和空氣的混合氣體，但也有使用標準氣相（5％CO2-5％O2-90％N2）組成進行體外胚胎的培養(yǎng)取得了良好的效果。在生理環(huán)境下，生殖管道并非與外界空氣相交通。根據(jù)不同的研究報道，兔輸卵管腔內(nèi)的氧氣濃度為2％-6％，倉鼠和獼猴輸卵管內(nèi)氧的濃度為8％。而子宮內(nèi)的氧濃度顯然低于輸卵管，倉鼠和兔為5％，獼猴為1.5％。對于多數(shù)哺乳動物的研究表明，降低氧氣濃度可以促進胚胎在體外的發(fā)育，這種現(xiàn)象在反芻動物中更明顯。降低氧氣濃度至5％-8％會促進多種動物胚胎發(fā)育至囊胚階段［15］。Varisangal等［16］對培養(yǎng)的氣相條件進行了探索，他們使用一種負壓氣相條件（5％ CO2、8％-10％ O2、300mmHg）培養(yǎng)重構克隆胚胎，比常壓氣相條件可顯著地提高囊胚發(fā)育率。該研究說明其原因可能是牛發(fā)情時子宮和輸卵管處于緊張狀態(tài)，子宮官腔中產(chǎn)生一定程度的負壓，該環(huán)境對初期胚胎的減數(shù)分裂具有支持作用。Machaty等［17］比較了兩種氣體對豬胚胎體外發(fā)育的影響，結(jié)果表明，5％CO2-Air更有利于豬胚胎的發(fā)育。本研究的結(jié)果表明，雖然兩種氣相組成對?？寺∨咛ツ遗甙l(fā)育率的影響差異不顯著，但是5％CO2-5％O2-90％N2氣相組成更有利于囊胚發(fā)育。同時這種標準氣相采用密閉的充氣袋進行體外培養(yǎng)，其優(yōu)點是使用方便、用量少，而且在封閉的環(huán)境中不受培養(yǎng)箱內(nèi)氣體濃度的變化而影響胚胎的發(fā)育，更接近體內(nèi)胚胎發(fā)育的氣相組成。

4 結(jié)論

供體組織來源、供體細胞同期與否以及受體去核方式對核移植胚胎發(fā)育沒有顯著的影響。培養(yǎng)的供體細胞直接注入到成熟17h后的盲吸去核后的受體卵子透明帶下構建克隆胚胎，克隆胚胎在密封的混合三氣（5％CO2-5％O2-90％N2）的氣相組成下進行體外培養(yǎng)，能保持穩(wěn)定的囊胚發(fā)育率。即簡化了核移植的程序，同時有利于奶?？寺〖夹g產(chǎn)業(yè)化應用。

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