Pseudomonas sp.101甲酸脫氫酶基因的合成、表達(dá)及定點(diǎn)飽和突變

李天明 朱靈桓 劉天佳 戴寶新 馮惠勇

氧化還原酶是催化制備羥基酸、手性醇、氨基酸等的一類重要的酶類。而在氧化還原酶所催化的反應(yīng)中，約80％的反應(yīng)需要尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，NADH）作為輔酶，一定量的輔酶會(huì)隨著合成產(chǎn)物的生成而消耗，因此氧化還原酶在應(yīng)用中特別需要高效、低成本的輔酶再生系統(tǒng)［1］。

甲酸脫氫酶（Formate Dehydrogenase，F(xiàn)DH，EC1.2.1.2）是氧化還原酶輔酶NAD+和NADH再生循環(huán)體系中的關(guān)鍵酶，它可以將甲酸氧化為CO2，同時(shí)將NAD+還原為NADH［2］。甲酸/甲酸脫氫酶作為NADH再生系統(tǒng)，其優(yōu)勢(shì)在于反應(yīng)不可逆，甲酸價(jià)格低廉且很多酶對(duì)此有很高的耐受性；此反應(yīng)只產(chǎn)生一種副產(chǎn)物CO2，對(duì)任何酶的活性均沒有任何影響，而且很容易從反應(yīng)體系中釋放出來，有利于產(chǎn)物的分離、純化［3］。在需要輔酶NADH再生的反應(yīng)中，甲酸脫氫酶具有重要的應(yīng)用價(jià)值和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。德國(guó)Degussa公司利用博伊丁假絲酵母（Candida boidinii）FDH再生NADH生產(chǎn)ter-L-亮氨酸，是成功利用酶法生產(chǎn)醫(yī)藥產(chǎn)品的典型例子之一［4］。

人工合成DNA是合成生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，利用重疊延伸PCR（gene splicing by overlap extension，SOE PCR）技術(shù)合成所需要的目的基因序列，在多個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［5］。本研究采用利用重疊延伸PCR，根據(jù)Pseudomonas sp.101來源的甲酸脫氫酶氨基酸序列［6］，成功合成了具有大腸桿菌堿基偏好性的FDH編碼基因，并在E.coli BL21（DE3）中得到高效表達(dá)；為提高FDH的穩(wěn)定性，采用融合PCR方法對(duì)FDH基因進(jìn)行了飽和定點(diǎn)突變，旨在為FDH的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 試驗(yàn)中需用的大腸桿菌E.coli DH5α，E.coli BL21（DE3）和pET-30a均為實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑 重疊PCR DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA Polymerase購(gòu)自NEB公司，限制性內(nèi)切酶、TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自大連寶生物工程公司（TaKaRa）；pEASY-T1克隆載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；其他試劑均為分析級(jí)產(chǎn)品，購(gòu)自生工生物（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因操作及蛋白質(zhì)操作 LB培養(yǎng)基、分子克隆、表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析參照文獻(xiàn)［7，8］進(jìn)行。DNA回收、質(zhì)粒提取等根據(jù)試劑盒提供方法進(jìn)行。

1.2.2 甲酸脫氫酶基因的合成

1.2.2.1 FDH的基因設(shè)計(jì) 按照Pseudomonas sp.101來源的甲酸脫氫酶氨基酸序列，選用大腸桿菌中高表達(dá)基因常用密碼子編碼，利用DNAWORKS在線軟件設(shè)計(jì)，將全長(zhǎng)1203bp的fdh基因分為48個(gè)片段，每個(gè)片段長(zhǎng)46個(gè)堿基，相鄰片段重疊部分為21bp，其中第一個(gè)和最后一個(gè)引物分別帶酶切位點(diǎn)BamH I和Hind III［9］。

1.2.2.2 fdh基因的合成 將1.2.2.1設(shè)計(jì)各引物等比例混和，引物之間互相搭橋、互為模板進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，63℃退火30s，72℃延伸23s，循環(huán)30次；72℃延伸10min。將上述PCR的彌散產(chǎn)物作為模板，由兩端引物再次進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性30s；98℃變性 10s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s，循環(huán)30次；72℃延伸10min。

1.2.2.3 fdh基因的克隆 純化第二次的PCR產(chǎn)物，與pEASY-T1連接，構(gòu)建pEASY-fdh質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含100μg/mL氨芐青霉素、IPTG和X-Gal的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落，提質(zhì)粒，用BamH I和Hind III雙酶切驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA序列測(cè)定。

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建及fdh基因的表達(dá) 將測(cè)序正確的pEASY-fdh質(zhì)粒和pET-30a質(zhì)粒分別用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切，片段與載體連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET30a-fdh，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli BL21（DE3），涂布含50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)12h，得到含fdh基因的重組E.coli。

把重組E.coli接種于含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD=0.6左右，加入誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度為1mmol/L，16℃搖床培養(yǎng)。從加誘導(dǎo)劑時(shí)開始計(jì)時(shí)，在0、2、4和6h時(shí)分別取樣1mL，用于SDS-PAGE電泳檢測(cè)［7］。

1.2.4 重組的甲酸脫氫酶分離純化 將1.5mL的菌液離心后收集菌體，重懸于20mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.5）中，懸浮后的菌體用超聲波破碎儀短時(shí)多次超聲破碎（工作功率為200-300 W，工作6s，間歇6s，破碎20次以上）。超聲破碎后的溶液低溫高速離心機(jī)離心后，取上清粗提液經(jīng)過用上述緩沖液平衡的親和層析微型鎳離子螯合柱，上柱結(jié)合后，用100mmol/L咪唑充分洗脫，收集目的蛋白，測(cè)定FDH的蛋白濃度（Bradford法）。

1.2.5 甲酸脫氫酶的酶活測(cè)定 測(cè)定FDH酶活可利用產(chǎn)物NADH在340nm有最大吸收峰，通過測(cè)定不同濃度的NADH在340nm處的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系如下：在10mmol/L pH7.5的磷酸溶液（含0.1mol/L β-巰基乙醇），1.67mmol/L NAD+，167mmol/L 甲 酸 鈉， 共 200μL， 加 入 100μL FDH酶液，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)，30℃反應(yīng)，每隔30 s檢測(cè)NADH在340nm處的吸收光度，作圖得出時(shí)間與吸光度增加量的斜率。配置不同濃度的NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液（0-0.6mmol/L）在340nm處測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。擬合回歸方程y=4.2429x-0.0093，計(jì)算每分鐘NADH的增加量。

FDH活力定義為在pH7.5，30℃條件下，每分鐘生成 1μmol NADH所需的酶量為 1個(gè)單位（U）［10］。

1.2.6 甲酸脫氫酶基因定點(diǎn)飽和突變 根據(jù)fdh基因序列以及要突變的位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。第146氨基酸位點(diǎn)突變引物，上游引物 FDH146F：5'-CGCTGAGGTTACTTACNNKAACTCCATAT-3'；下游引物 FDH14-6R：5'-AACTGATATGGAGTTMNNGTAAGTAACCT-3'；PCR擴(kuò)增各段小片段基因：146-1、146-2，獲得片段后，用兩端引物進(jìn)行搭接。以搭接后的PCR產(chǎn)物為模板，再進(jìn)行第354氨基酸位點(diǎn)突變，引物分別為：上游引物 FDH354F：5'-TCTTGGAGNNKTTCTTCGAGGGTC-3'；下游引物 FDH354R：5'-GACCCTCGAAGAAMNNCTCCAAGATT-3'，獲得 354-1以及354-2片段，用兩端引物進(jìn)行搭接。兩次搭接反應(yīng)體系如下：146-1和146-2片段（或者354-1和354-2片段）各0.5μL，上下游引物（20μmol/L）各0.5μL，10×Buffer 2.5μL，dNTPs 4μL，TaKaRa Ex Taq 1μL。將 PCR 產(chǎn)物純化、連接 pET-30a，轉(zhuǎn)化 E.coli BL21（DE3）［11］。

利用LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，誘導(dǎo)表達(dá)FDH，菌液離心，溶菌酶磷酸緩沖液裂解細(xì)胞，獲得粗酶液［12］，30℃保溫10h，用96微孔板分別測(cè)定保溫前后酶的酶活，酶活降低小的突變酶，為穩(wěn)定性高的突變酶。

2 結(jié)果

2.1 fdh基因合成和表達(dá)載體構(gòu)建

FDH基因合成、克隆及表達(dá)載體構(gòu)建的技術(shù)路線如圖1所示。

圖1 fdh基因合成、克隆及表達(dá)載體構(gòu)建技術(shù)路線圖

2.1.1 fdh基因的合成和克隆 通過重疊PCR擴(kuò)增得到彌散條帶，見圖2-A，以此產(chǎn)物為模板，加入兩端引物，通過PCR擴(kuò)增得到1200bp的條帶，與預(yù)計(jì)fdh基因大小一致，見圖2-B。純化PCR 產(chǎn)物，采用TA互補(bǔ)將回收的片段直接克隆法連接到T載體pEASY-T1上。挑選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，用BamH I和Hind III對(duì)構(gòu)建的pEASY-fdh進(jìn)行酶切驗(yàn)證，從圖2-C可以看出，fdh與T載體連接成功。

圖2 fdh基因的合成和克隆

2.1.2 序列測(cè)定和分析 重組陽(yáng)性質(zhì)粒pEASY-fdh經(jīng)測(cè)序結(jié)果表明，甲酸脫氫酶fdh的基因長(zhǎng)1203bp，將基因序列用DNAclub軟件翻譯為氨基酸序列后，與DNAWORKS在線軟件設(shè)計(jì)的序列比對(duì)同源性達(dá)100％，說明pEASY-fdh構(gòu)建成功。

2.1.3 表達(dá)載體pET30a-fdh的構(gòu)建和驗(yàn)證 構(gòu)建了質(zhì)粒pET30a-fdh，用BamH I和Hind III酶切分析，酶切結(jié)果如圖3所示，質(zhì)粒pET30a-fdh被切成兩條帶，分別為5400bp的pET-30a質(zhì)粒和1200bp的fdh基因條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖3 重組質(zhì)粒pET30a-fdh酶切驗(yàn)證

2.2 FDH蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

在OD達(dá)到0.6時(shí)，加入終濃度1mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，16℃培養(yǎng)，分別在2、4和6h時(shí)取樣，收集菌體，破碎細(xì)胞后利用12％的SDS-PAGE對(duì)誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行分析，其蛋白電泳結(jié)果（圖4）顯示，在45kD處發(fā)現(xiàn)目的條帶，在誘導(dǎo)2-6h后，F(xiàn)DH蛋白均有表達(dá)，并且蛋白的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而有所增加。由此可分析到，pET30a-fdh誘導(dǎo)后表達(dá)的蛋白約為45kD，此分子量與在線軟件ExPASy-Compute pI-Mw tool分析的分子量44.5kD大小相符，說明該蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。

圖4 IPTG誘導(dǎo)fdh基因表達(dá)

2.3 FDH的比酶活

將誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)鎳柱純化后，測(cè)定純化后的酶液蛋白濃度，進(jìn)行酶活檢測(cè)，根據(jù)回歸方程得出每分鐘NADH的增加量，其獲得結(jié)果如表1所示，計(jì)算得到重組酶FDH的比活力為8.7U/mg。

表1 FDH比活力的測(cè)定

2.4 甲酸脫氫酶基因的飽和定點(diǎn)突變

2.4.1 甲酸脫氫酶基因146、354位點(diǎn)突變 表達(dá)的FDH在使用中不穩(wěn)定，極易失活，主要是因?yàn)橛捎诳諝庵醒趸蚧|(zhì)中其他化學(xué)物質(zhì)的作用，半胱氨酸的氧化使FDH 失去活性。根據(jù)α螺旋疏水化處理靜電作用和多肽的優(yōu)化可以提高蛋白穩(wěn)定性的原理［13］，選擇對(duì)Cys146和Cys354兩個(gè)位點(diǎn)先后進(jìn)行飽和突變，以獲得高穩(wěn)定性的突變酶。通過重疊延伸PCR，在1200bp左右獲得條帶，位置與目的片段位置一致，結(jié)果如圖5所示，為獲得有效的突變體文庫(kù)提供充足的基因片段。

圖5 重疊延伸PCR擴(kuò)增電泳圖

2.4.2 飽和突變體庫(kù)篩選結(jié)果分析 構(gòu)建了突變后的質(zhì)粒pET30a-fdh，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，用96微孔板進(jìn)行突變體篩選。共篩選了763個(gè)轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子中大部分的酶活保溫前后變化較大，經(jīng)過多輪復(fù)篩，只篩選出一個(gè)突變子酶活變化較小的突變酶（數(shù)據(jù)略），經(jīng)測(cè)序是Cys146Ala和Cys354Ala雙位點(diǎn)突變。2.4.3 突變子比酶活的研究 野生型菌株和Cys146AlaCys354Ala的突變型菌株，同時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)鎳柱純化后，測(cè)定酶活，經(jīng)計(jì)算得出結(jié)果如表2所示，突變前后FDH的比活力相差無(wú)幾，沒有明顯變化。

表2 突變前后FDH比活力的測(cè)定

2.4.4 突變子熱穩(wěn)定性的研究 將野生型菌株和Cys146AlaCys354Ala的突變型菌株，分別16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，制成粗酶，置于30℃水浴中保溫，分別于0、2、4、6、8和10h取樣，測(cè)定其酶活力，以保溫前的酶活力為100％，結(jié)果如圖6所示，酶活呈指數(shù)型下降，利用指數(shù)函數(shù)對(duì)其擬合，經(jīng)推算野生酶的半衰期為5.4h，突變酶的半衰期為13.8h，突變后fdh基因的熱穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于野生型。

圖6 穩(wěn)定性變化曲線

3 討論

甲酸脫氫酶在輔酶再生中的應(yīng)用已成為輔酶法再生領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。甲酸/甲酸脫氫酶體系是最成功的再生系統(tǒng)，并且已經(jīng)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。其最大優(yōu)勢(shì)在于反應(yīng)的不可逆性，原料甲酸價(jià)格低廉以及唯一副產(chǎn)物CO2不會(huì)殘留在體系中。人工合成基因已經(jīng)是分子生物學(xué)中的一種常規(guī)技術(shù)，并且成為修改和克隆基因的強(qiáng)力工具。目前，雖然經(jīng)過十幾年的不斷實(shí)踐和總結(jié)，重疊延伸PCR方法已日益成熟，并在許多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，但是作為一種尚未標(biāo)準(zhǔn)化反應(yīng)條件的技術(shù)，重疊延伸PCR技術(shù)在應(yīng)用過程中還有許多問題急需解決，例如，最適合的引物長(zhǎng)度大小，最優(yōu)連續(xù)延伸的循環(huán)數(shù)，還有對(duì)合成進(jìn)程中最佳分步控制等。這些問題還需進(jìn)一步系統(tǒng)研究，為該技術(shù)的應(yīng)用提供更多理論支持［14］。

本研究按照Pseudomonas sp.101來源的甲酸脫氫酶氨基酸序列，采用重疊延伸PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)引物，并且通過不斷調(diào)整退火溫度及延伸循環(huán)數(shù)，合成了具有大腸桿菌密碼子偏好性的fdh基因，經(jīng)測(cè)序核酸序列與設(shè)計(jì)的同源性達(dá)到100％，合成過程中沒有出現(xiàn)錯(cuò)配等現(xiàn)象。同時(shí)構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET30a-fdh，獲得了基因工程菌pET30a-fdh/BL21（DE3）。通過IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析可發(fā)現(xiàn)FDH蛋白得到表達(dá)，并且蛋白的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而有所增加。由于重組的FDH在蛋白質(zhì)C端融合有6×His標(biāo)簽，并且它對(duì)FDH的酶活性沒有影響，從而將誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)鎳柱純化后，測(cè)得FDH的酶比活力達(dá)到8.7U/mg，與Tishkov［6］報(bào)道的FDH的比活力9.5U/mg相近。由于空氣中氧或基質(zhì)中其他化學(xué)物質(zhì)的作用，同時(shí)半胱氨酸的氧化也會(huì)使FDH 失去活性，因而表達(dá)的FDH在使用中不穩(wěn)定，極易失活。根據(jù)α螺旋疏水化處理靜電作用和多肽的優(yōu)化可以提高蛋白穩(wěn)定性的原理，選擇對(duì)Cys146和Cys354兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變，篩選出突變體后誘導(dǎo)表達(dá)，測(cè)定發(fā)現(xiàn)突變前后酶活變化不明顯，但突變后酶的熱穩(wěn)定性得到提高。

隨著氧化還原酶在催化制備有機(jī)化學(xué)品等方面優(yōu)勢(shì)的凸顯，F(xiàn)DH的改造及在輔酶再生方面的應(yīng)用越來越受到研究者的關(guān)注。但是，目前FDH的穩(wěn)定性、催化效率還有待進(jìn)一步提高；還需建立高效的表達(dá)體系和優(yōu)化催化反應(yīng)體系，降低生產(chǎn)成本，拓展FDH的更廣泛的應(yīng)用［15］。

4 結(jié)論

利用重疊延伸PCR技術(shù)，按照Pseudomonas sp.101來源的甲酸脫氫酶氨基酸序列設(shè)計(jì)重疊引物，合成了具有大腸桿菌密碼子偏好性的fdh基因，與DNAWORKS在線軟件設(shè)計(jì)的基因序列100％同源。構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET30a-fdh，獲得了基因工程菌 pET30a-fdh/BL21（DE3）， 在 595nm 下 OD 達(dá) 到0.6時(shí)，加入終濃度1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)了FDH的可溶性活性表達(dá)，酶的比活力達(dá)到8.7U/mg。由于FDH不穩(wěn)定，極易失活，根據(jù)α螺旋疏水化處理靜電作用和多肽的優(yōu)化可以提高蛋白穩(wěn)定性的原理，選擇對(duì)Cys146和Cys354兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變；經(jīng)篩選，獲得的Cys146AlaCys354Ala突變酶與野生酶相比，比酶活沒有變化，但突變酶的熱穩(wěn)定性提高了2.5倍。

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