蛋白印跡法檢測(cè)梅毒IgG抗體

鄒宇斌 林燕霞 郭健英 梁 平

1.廣東東莞市沙田醫(yī)院皮膚科，廣東東莞 523980；2.廣東東莞市沙田醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 523980；3.廣東東莞市康華醫(yī)院皮膚科，廣東東莞 523000

梅毒是由梅毒螺旋體引起的一種性傳播疾病。不論出現(xiàn)假陽性還是假陰性結(jié)果，對(duì)患者本人及其親友都有重大影響，也容易引起醫(yī)療糾紛，因此對(duì)結(jié)果的報(bào)告必須慎重。國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室診斷主要依賴血清學(xué)方法，一般為檢測(cè)梅毒非特異性抗體的TRUST和檢測(cè)梅毒特異性抗體的TPPA聯(lián)合篩選。WB是近二十余年新發(fā)展起來的一種先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)。本文以TRUST、TPPA作為對(duì)照，對(duì)蛋白印跡法檢測(cè)梅毒IgG抗體的若干問題作一探討。

1 材料與方法

1.1 血清來源

臨床確診的24例梅毒孕婦分娩后，取新生兒的靜脈血，共24份。

1.2 試劑和方法

取母親靜脈血進(jìn)行TRUST和TPPA試驗(yàn)；取新生兒靜脈血進(jìn)行TRUST、TPPA和TP-IgG-WB試驗(yàn)。試劑來源：①TRUST試劑：由上海榮盛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；②TPPA試劑：由日本富士瑞必歐株式會(huì)社生產(chǎn)：③TP-IgG-WB試劑盒：由德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室有限公司生產(chǎn)。試驗(yàn)方法：①TRUST試驗(yàn)方法：分別吸取50ul梅毒陽性對(duì)照和陰性對(duì)照均勻鋪加在紙卡的兩個(gè)圓圈中，取待檢血清50 uL置于紙卡的另一圓圈中，然后用專用滴管垂直分別滴加TRUST試劑1滴于上述血清中，按每分鐘100轉(zhuǎn)，搖動(dòng)8 min，肉眼觀察。②TPPA試驗(yàn)方法：用微量滴管將血清稀釋液滴入反應(yīng)板第1孔中，共計(jì)100 μL，從第2孔至第4孔各滴25 μL。用微量移液管取樣品25 μL至第1孔中。然后從第1孔倍比稀釋至第4孔。用試劑盒中提供的滴管在第3孔中滴入25 μL未致敏顆粒，在第4孔中滴入25 μL致敏顆粒。置微型振蕩器振蕩30 s，置有蓋濕盒內(nèi)，室溫（15～ 30℃）2 h后觀察結(jié)果。

1.3 蛋白印跡法

當(dāng)硝酸纖維素薄膜（印跡膜）上出現(xiàn)兩條或兩條以上分子量為15Kda、17 Kda、45Kda和47Kda的多肽抗原條帶時(shí)，結(jié)果判斷為陽性。當(dāng)印跡膜上無顯色帶或僅出現(xiàn)分子量為22 Kda多肽抗原條帶，結(jié)果為陰性。陽性結(jié)果不再根據(jù)條帶顯色強(qiáng)弱進(jìn)行分級(jí)。

2 結(jié)果

24例梅毒孕婦新生兒血清標(biāo)本TRUST18例陽性，TPPA和WB24例均為陽性（表1）。WB24例均檢測(cè)出針對(duì)15Kda、17Kda、45Kda和47Kda多肽抗原抗體。

表1 三種方法檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

梅毒螺旋體進(jìn)入人體后首先刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgM抗體，然后是IgG抗體。IgG抗體是體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體，是血清和細(xì)胞外液中最主要的抗體成分，在血清中含量最高，約占免疫球蛋白的75%。IgG抗體為四鏈單體，分子量150kda，相對(duì)較小，梅毒孕婦的IgG抗體可穿過胎盤滋養(yǎng)層，進(jìn)入胎兒的血液循環(huán)，但如果新生兒已被感染，新生兒也有可能產(chǎn)生IgG抗體。因此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的IgG抗體有可能來自于母子雙方。

蛋白印跡法是一種診斷梅毒感染的特異性實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的梅毒螺旋體多肽成分，轉(zhuǎn)移到印跡膜上，以非共價(jià)鍵形式吸附，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以印跡膜多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的梅毒特異性抗體起免疫反應(yīng)，再與酶標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，底物顯色后，則在印跡膜上相應(yīng)的特異性多肽抗原位置出現(xiàn)顯色條帶。不同的研究者對(duì)采用蛋白印跡法所呈現(xiàn)的梅毒螺旋體特異性抗原區(qū)帶結(jié)果報(bào)道存在一定的差異，Robert[1]等報(bào)道印跡膜上針對(duì)分子量為14700（土600），17300（士700），44300（士600）和46900（士800）道爾頓的四條區(qū)帶為梅毒螺旋體特異性抗原帶，上述四條區(qū)帶中出現(xiàn)三條即可判斷結(jié)果為陽性；Fujimura等[2]認(rèn)為分子量17 000、15 000、47 000、42 000道爾頓的4種抗原為梅毒特異性抗原。本文中采用的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)與文獻(xiàn)報(bào)道的判斷標(biāo)準(zhǔn)不完全一致。

本次24份標(biāo)本，TRUST只檢出18份陽性，有6份陰性。但是用WB檢測(cè)，24份均為陽性。TRUST檢測(cè)的并非梅毒特異性抗體，而是心磷脂抗體，并且標(biāo)本溶血、血清不新鮮以及器皿污染等多種因素可以影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其特異性和敏感性均不理想。有報(bào)道在梅毒感染低危人群中，TRUST檢出特異性為96%[3]，敏感性為47.3%[4]。由于感染梅毒后心磷脂抗體出現(xiàn)晚于特異性梅毒抗體，晚期梅毒中此類抗體又逐漸轉(zhuǎn)陰，因此不適用于一、三期梅毒。

本次24份標(biāo)本，TPPA與WB檢測(cè)均為陽性。這與韓曉峰等[5]的結(jié)果一致。TPPA是目前國(guó)內(nèi)常用的梅毒血清學(xué)確診實(shí)驗(yàn)，其敏感性、特異性均較高，被譽(yù)為“確證實(shí)驗(yàn)”，但這種實(shí)驗(yàn)并非完美無缺，仍可出現(xiàn)生物學(xué)假陽性[6-7]。TPPA采用的是純化的致病性梅毒螺旋體（Nichols株）菌體抗原，針對(duì)的是TP15、TP45的抗體[8]，所以當(dāng)僅有TP17、TP47抗體時(shí)，TPPA無法出現(xiàn)陽性。針對(duì)TP15、TP45的抗體消失或降低時(shí)，又會(huì)導(dǎo)致TPPA的假陰性。有研究結(jié)果報(bào)道[9]，TP47為梅毒早期診斷指標(biāo)，SATO等[10]亦報(bào)道TP15是活動(dòng)期梅毒標(biāo)志性抗體。蛋白印跡法印跡膜上吸附有15Kda、17Kda、45Kda和47Kda的多肽抗原條帶，避免了TPPA的固有缺陷。本實(shí)驗(yàn)使用WB檢測(cè)，24例均檢測(cè)出針對(duì)15Kda、17Kda、45Kda和47Kda多肽抗原抗體，因此可以解釋為何24例標(biāo)本兩方法檢測(cè)均為陽性。

蛋白印跡法結(jié)合了免疫學(xué)和生物化學(xué)的特點(diǎn)，特異性強(qiáng)，敏感性高，不需特殊的儀器設(shè)備，觀察結(jié)果不帶有主觀性，操作人員不需經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)和較多的經(jīng)驗(yàn)即可完成整個(gè)檢測(cè)過程，是理想的一種梅毒確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。

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