Bmi-1和hTERT在胃癌組織中的表達(dá)及臨床病理意義

劉曉麗 馬禮鴻 王 凱 (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，貴州 遵義 563003)

腫瘤與原癌基因激活、抑癌基因失活所造成的腫瘤細(xì)胞惡性增殖、免疫逃逸密切相關(guān)。Bmi-1和hTERT是與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的基因〔1〕。本研究旨在探討B(tài)mi-1和hTERT在老年胃癌組織中的表達(dá)情況及其與病理分期的相關(guān)關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2005年1月至2012年5月我院老年胃癌患者100例作為觀察組，其中男67例，女33例，年齡43～61〔平均(52.38±6.38)〕歲;選擇在我院就診的胃良性腫瘤患者50例作為良性對(duì)照組，其中男34例，女16例，年齡39～60〔平均(52.39±6.32)〕歲;選擇在我院進(jìn)行體檢的100名健康者作為健康對(duì)照組，其中男 65例、女 35例，年齡 40～60〔平均(50.98±6.29)〕歲。三組一般資料的差異不顯著(P＞0.05)。

1.2 熒光定量PCR檢測(cè)方法 取胃組織50 mg并用購買于Invitrogen公司的mRNA抽提及反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。熒光定量PCR采用Takara公司的試劑盒，擴(kuò)增體系:cDNA 2 μl、mastermix 10 μl、上下游引物各 0.4 μl、去離子水 7.2 μl;擴(kuò)增條件:95℃、15 s，特異性退火溫度72℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列:β-actin:上游5'-TGTGTTGGCGTACAGGICTTTG-3'，下游5'-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3'，退火溫度58.1℃。Bmi-1:上 游 5'-GCCCGCTGCTGTCTAATG-3'，下 游 5'-TTTACACGT CT CGGATCTTG-3'，退火溫度 60.8℃;hTERT:上游:5'-AAGATGGTTACCTGCGACTG-3'， 下 游:5'-CCGGGTCTGGAACGATGACC-3'，退火溫度62.1℃。分別擴(kuò)增同一樣本的目的基因和內(nèi)參基因，通過ΔΔCt法求出觀察組、良性對(duì)照組相對(duì)于健康對(duì)照組的mRNA含量。

1.3 免疫印跡檢測(cè)方法 取胃組織50 mg加入蛋白裂解液300 μl后勻漿，離心后取上清 15.6 μl，加入上樣緩沖液 4 μl、DTT 2.4 μl配成上樣液。按配方配置10%的下層膠和5%的上層膠進(jìn)行垂直電泳，100 V、20 min，120 V、90 min。垂直電泳結(jié)束后取出凝膠進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜，封閉后加入羊來源的Bmi-1和hTERT第一抗體，4℃孵育過夜。TBST洗3遍，加HRP標(biāo)記的驢抗羊二抗孵育1 h，而后進(jìn)行顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行方差分析和單因素回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 各組胃組織中Bmi-1和hTERT的mRNA和蛋白含量觀察組胃組織Bmi-1和hTERT的mRNA和蛋白含量均明顯高于良性對(duì)照組和健康對(duì)照組(P＜0.05)。見表1。

2.2 胃癌患者不同TNM分期Bmi-1和hTERT的mRNA和蛋白含量 在不同TNM分期的觀察組患者中，Bmi-1、hTERT的mRNA含量TNMⅠ＜TNMⅡ＜TNMⅢ＜TNMⅣ(P＜0.05)。見表2。

2.3 胃癌患者TNM分期與Bmi-1和hTERT含量的相關(guān)性胃癌患者的Bmi-1、hTERT的蛋白含量與TNM分期呈正相關(guān)(r=0.572、0.492，P ＜0.05)。見表3。

表1 各組Bmi-1、hTERT的mRNA和蛋白含量比較(±s)

表1 各組Bmi-1、hTERT的mRNA和蛋白含量比較(±s)

組別 n mRNA含量(ratio)Bmi-1 hTERT蛋白含量(ratio)Bmi-1 hTERT觀察組 100 235.94±24.77 245.48±25.21 251.52±27.12267.41±29.42良性對(duì)照組 50 105.32±11.23 103.16±14.32 103.63±11.90 103.82±15.12健康對(duì)照組100 100 100 100 100 F/P值 9.758/＜0.05 10.382/＜0.05 9.758/＜0.05 10.382/＜0.05

表2 胃癌患者不同TNM分期Bmi-1、hTERT的mRNA和蛋白含量比較(±s)

表2 胃癌患者不同TNM分期Bmi-1、hTERT的mRNA和蛋白含量比較(±s)

TNM分期 n mRNA含量(ratio)Bmi-1 hTERT 蛋白含量(ratio)Bmi-1 hTERT TNMⅠ 23 123.56±11.42 135.26±13.98 115.56±12.22 129.43±13.23 TNMⅡ 28 165.13±14.53 175.96±18.21 145.13±15.41 169.55±17.52 TNMⅢ 30 245.94±25.88 268.55±29.52 235.94±26.13 262.95±28.32 TNMⅣ 19 358.25±39.6 396.05±40.17 328.52±34.6 346.42±35.23 F/P值 9.758/＜0.05 10.382/＜0.05 9.758/＜0.05 10.382/＜0.05

表3 胃癌患者病理分期與Bmi-1和hTERT含量的相關(guān)性

3 討論

近年來，越來越多的臨床試驗(yàn)和基礎(chǔ)研究均極為關(guān)注胃癌發(fā)生的分子機(jī)制，旨在通過研究其分子機(jī)制來發(fā)現(xiàn)早期診斷胃癌的標(biāo)志物〔3〕。目前認(rèn)為，胃癌的發(fā)生與原癌基因激活、抑癌基因失活所造成的腫瘤細(xì)胞惡性增殖、免疫逃逸密切相關(guān)。其中，Bmi-1是一類原癌基因，在乳腺癌、直腸癌、肺癌等腫瘤中均有高表達(dá)〔3〕。相關(guān)研究顯示，Bmi-1所編碼的蛋白能夠?qū)16、p19等抑癌基因發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。在體內(nèi)，p16、p19基因主要編碼與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白，能夠參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老的調(diào)控〔4，5〕。hTERT是編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的基因，僅在干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，參與端粒的復(fù)制〔6〕。當(dāng)機(jī)體在環(huán)境因素、遺傳因素等作用下發(fā)生Bmi-1、hTERT基因過度表達(dá)時(shí)，一方面會(huì)抑制p16、p19基因編碼細(xì)胞周期蛋白，另一方面會(huì)造成端粒酶mRNA不斷復(fù)制、不會(huì)隨細(xì)胞增殖而縮短〔7〕。兩者共同作用會(huì)造成細(xì)胞的增殖、DNA的復(fù)制不受抑制，發(fā)生惡性增殖，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生〔8〕。Bmi-1、hTERT基因的表達(dá)異常與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)〔9〕。

本研究結(jié)果提示Bmi-1、hTERT基因的蛋白水平與腫瘤分期呈正相關(guān)，即腫瘤分期越高、Bmi-1和hTERT基因表達(dá)越多。

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