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    人臍血和外周血單個核細胞中神經(jīng)營養(yǎng)因子表達水平研究

    2013-09-12 08:55:30范存剛王棟梁張慶俊周景儒
    山東醫(yī)藥 2013年33期
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)液外周血干細胞

    范存剛,王棟梁,張慶俊,周景儒

    (北京大學(xué)人民醫(yī)院,北京 100044)

    隨著干細胞研究的深入,干細胞移植有望成為 治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新方法。雖然已有胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞修復(fù)神經(jīng)損傷的報道[1,2],但由于目前存在神經(jīng)干細胞數(shù)量有限、取材困難,胚胎干細胞分離純化技術(shù)困難、倫理與法律爭議和形成畸胎瘤的風(fēng)險,骨髓間充質(zhì)干細胞隨供者年齡增長出現(xiàn)含量和增殖能力下降的諸多問題[2,3],因此,尋找可靠而易于獲得的細胞來源,成為細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的首要問題。人臍血細胞具有來源豐富、采集方便、無倫理和法律障礙等優(yōu)點,能在適宜的條件下分化為神經(jīng)細胞并修復(fù)神經(jīng)損傷[4],故有望成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想細胞來源。然而,體內(nèi)移植后,僅有不足10%的人臍血單個核細胞(UCB-MNCs)表達神經(jīng)表型[4],難以解決動物模型或患者神經(jīng)功能的迅速恢復(fù)問題。2009~2011年,我們檢測了UCB-MNCs、成人外周血單個核細胞(APB-MNCs)內(nèi)5 種神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達水平,旨在為闡明UCB-MNCs 修復(fù)神經(jīng)損傷的機制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料 人臍血取自我院產(chǎn)科15例足月妊娠、正常分娩產(chǎn)婦的嬰兒臍血,成人外周血取自我院健康查體的12例年齡22~38歲的成人外周血,均在無菌條件下采集。將臍血及外周血貯存于4 ℃冰箱內(nèi),在6 h 內(nèi)進行細胞分離。1%牛血清白蛋白購自Sigma 公司;LG-DMEM、胎牛血清和青霉素、鏈霉素均為Gibico 公司產(chǎn)品;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子-4/5(NT-4/5)的ELISA 試劑盒分別購自Chemicon 公司和Promega 公司;5 種神經(jīng)營養(yǎng)因子的引物均由上海生工生物合成。

    1.2 方法

    1.2.1 UCB-MNCs、APB-MNCs 分離 先將每份血標(biāo)本以含1%牛血清白蛋白的無菌PBS 液按1∶1 比例稀釋,緩慢加入Ficoll-Paque,以800 g 離心25 min;然后于梯度界面收集MNCs,并以PBS 洗滌兩次。先從每份分離的MNCs 中取出2 ×106個細胞,用于RNA 提取和PCR 檢測。然后將剩余的MNCs以1 ×106個/cm2接種于含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的LG-DMEM 中,于37℃、含5% CO2的孵箱中培養(yǎng)10 d;然后收集培養(yǎng)液上清進行酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。

    1.2.2 RNA 提取及引物合成 采用Trizol 提取液、按Trizol 使用說明書推薦的方法提取MNCs 中的總RNA,以260 nm 分光光度測定進行RNA 定量。逆轉(zhuǎn)錄體系的終體積為40 μL,其中含有2 μL 500 μg/mL的隨機引物、2 μL 10 mmol/L的dNTP、2 μg 總RNA、16 μL 雙蒸水。逆轉(zhuǎn)錄體系在65 ℃水浴中孵育5 min 后,加入8 μL 5 ×緩沖液、2 μL RNA 酶抑制劑、4 μL 0.1 mol/L的二硫蘇糖醇,37 ℃孵育2 min 后加入2 μL 小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶;37 ℃孵育1.5 h 后放入95 ℃水浴中10 min,再置于冰上5 min,以滅活轉(zhuǎn)錄酶。

    5 種神經(jīng)營養(yǎng)因子和內(nèi)參(β-actin)的引物分別為:①膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)(400 bp):上游引物:5'-TTATGGGATGTCGTGGCTG-3',下游引物:5'-TTTCATAGCCCAGACCCAAG-3'。②神經(jīng)生長因子(NGF)(167 bp):上游引物:5'-ATACAGGCGGAACCA CAC-3',下游引物:5'-GTAATGTTGCG GGTCTGC-3'。③神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)(201 bp):上游引物:5'-TTGCCAGAAGACTCGCTC-3',下游引物:5'-CAGTTCGGTGTCCATTGC-3'。④NT-5(246 bp):上游引物:5'-TAACGCTGAGGAAGGTGG-3',下游引物:5'-AGGTCTCTCAGCATCCAG-3'。⑤BDNF(744 bp):上游引物:5'-ATGACCATC CTTTTCCTTAC-3'。下游引物:5'-CTATCTTCCCCTT TTAATGG-3'。⑥β-actin(578 bp):上游引物:5'-AT CTGGCACACCTTCTACA-3',下游引物:5'-GTTTCGT GGATGATGCAACAGGACT-3'。

    1.2.3 神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA 表達檢測 采用RTPCR 技術(shù)檢測UCB-MNCs、APB-MNCs 中的GDNF、BDNF、NGF、NT-3、NT-4/5的mRNA 表達。電泳PCR 擴增體系的終體積為50 μL,各種成分的終濃度分別為dNTP 0.25 mmol/L、MgCl22.5 mmol/L、Taq DNA 聚合酶2.5 U/100 mL、KCl 50 mmol/L、Tris-HCl 緩沖液(pH 8.3)10 mmol/L。BDNF的循環(huán)條件為94 ℃、30 s,55 ℃、45 s,72 ℃、45 s;GDNF、NGF、NT-3 和NT-4/5的循環(huán)條件為94 ℃、30 s,52 ℃、30 s,72 ℃、30 s。PCR 產(chǎn)物在含有EB的2%瓊脂糖凝膠中電泳,電泳結(jié)果在紫外線燈光下觀察,并以數(shù)碼照相系統(tǒng)采集圖片。

    1.2.4 BDNF、NT-4/5 分泌檢測 采用ELISA 法檢測UCB-MNCs 和APB-MNCs 培養(yǎng)液上清中的BDNF、NT-4/5 分泌水平,按照BDNF、NT4/5的ELISA試劑盒說明書進行操作。

    1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 BNDF 和NT4/5的分泌水平以±s 表示,以t 檢驗進行比較。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 UCB-MNCs、APB-MNCs 培養(yǎng)結(jié)果 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),UCB-MNCs、APB-MNCs 在培養(yǎng)24 h 時均有部分細胞懸浮,更換培養(yǎng)液后大部分細胞開始呈貼壁生長,并呈現(xiàn)圓形、卵圓形、紡錘形等細胞形態(tài)。培養(yǎng)第10 天時,上述細胞均達到80%~90%的匯合程度。

    2.2 UCB-MNCs、APB-MNCs 中各神經(jīng)營養(yǎng)因子的mRNA 表達 RT-PCR 檢測顯示,UCB-MNCs 中的GDNF、BDNF、NGF、NT-3、NT-4/5的mRNA 表達水平均高于APB-MNCs(見圖1)。

    圖1 UCB-MNCs、APB-MNCs 中GDNF、NT-5、NGF、NT-3 和BDNF的mRNA 表達

    2.3 UCB-MNCs、APB-MNCs 培養(yǎng)液上清中的BDNF、NT-4/5 分泌差異 ELISA 法檢測顯示,UCBMNCs、APB-MNCs 培養(yǎng)第10 天時,其培養(yǎng)液上清中的BDNF 分 泌 水 平 分 別 為(827.50± 48.68)、(155.65±56.03)pg/mL,NT4/5 分別為(236.64±7.51)、(60.53±10.81)pg/mL,即UCB-MNCs 培養(yǎng)液上清中的BDNF、NT4/5 分泌水平分別約為APBMNCs的5、4 倍(P 均<0.01)。

    3 討論

    近來研究表明,人臍血細胞能在體內(nèi)外環(huán)境中被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞[5],且能明顯改善腦外傷[6]、腦梗死[7]、脊髓損傷[8]等神經(jīng)系統(tǒng)疾病動物模型的神經(jīng)功能。然而,現(xiàn)有的體內(nèi)外研究均難以解釋低比例人臍血細胞分化為神經(jīng)細胞如何發(fā)揮明顯的促進神經(jīng)功能恢復(fù)。因此,人們推測人臍血細胞除了通過分化為神經(jīng)細胞發(fā)揮細胞替代作用之外,其修復(fù)神經(jīng)損傷的機制還可能與分泌某些細胞因子的神經(jīng)保護作用有關(guān)[9]。

    神經(jīng)營養(yǎng)因子是在神經(jīng)元細胞的發(fā)育、生長和成熟神經(jīng)元功能的維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用的一類蛋白質(zhì),其中GDNF、BDNF、NGF、NT-3、NT-4/5 是研究最廣泛的5 種神經(jīng)營養(yǎng)因子。NGF 是人們發(fā)現(xiàn)的第1種神經(jīng)營養(yǎng)因子,對交感和感覺神經(jīng)元的存活和維系至關(guān)重要,并可促進軸突生長[10]。隨后研究者又發(fā)現(xiàn),BDNF 具有促進中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)現(xiàn)有神經(jīng)元存活、促進新生神經(jīng)元和軸突生長及分化的作用[11]。NT-3 是人們發(fā)現(xiàn)的第3 種神經(jīng)營養(yǎng)因子,與NT-4/5 分 別 通 過TrkC 和TrkB 受 體 結(jié) 合,發(fā)揮促進神經(jīng)元存活、增殖及軸突再生的作用[12]。GDNF 是一種能夠促進多巴胺能神經(jīng)元和運動神經(jīng)元存活的小分子蛋白,是第1個被發(fā)現(xiàn)并命名的GDNF 家族成員[13]。

    本研究顯示,UCB-MNCs 中的GDNF、BDNF、NGF、NT-3、NT-5 mRNA 表達 水平 均 高 于APBMNCs,UCB-MNCs 培養(yǎng)液上清中的BDNF、NT4/5 分泌水平,分別約為APB-MNCs的5、4 倍。由此我們推測,UCB-MNCs 中的神經(jīng)營養(yǎng)因子高表達和分泌可能是其修復(fù)神經(jīng)損傷的機制之一,將來有必要在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動物模型中對該機制進行更加深入的研究。

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