電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠谷氨酸和γ-氨基丁酸的影響

郭真真 吳毅 賈杰 吳志遠(yuǎn) 李明芬

1990年Kitagawa等［1］發(fā)現(xiàn)對(duì)腦組織進(jìn)行短暫缺血預(yù)處理后，可以產(chǎn)生“腦缺血耐受(brain ischemic tolerance)”。隨后研究發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)腦缺血耐受的預(yù)處理方法有缺氧/高氧［2］、藥物［3］、低溫［4］、運(yùn)動(dòng)［5］、缺血［6］和電針［7-15］等多種。

電針作為一種對(duì)機(jī)體刺激較小且行之有效的預(yù)處理方法，得到了研究人員的重視，并取得了很大進(jìn)展。研究證明，電針預(yù)處理可明顯減少缺血區(qū)腦細(xì)胞的凋亡［16］，減小腦梗死體積，顯著減輕大鼠的神經(jīng)功能損害程度［17］，并能改善大鼠缺血后突觸的超微結(jié)構(gòu)從而影響突觸的可塑性［18］。相應(yīng)的機(jī)制研究表明，電針預(yù)處理可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元NMDA受體2A和2B的表達(dá)［19-20］，而重復(fù)電針預(yù)處理可增加內(nèi)源性大麻素及其受體［21］;Davies 等［22］及 Silkis 等［23］研究表明，大麻素與GABA、谷氨酸(glutamate，Glu)相互作用而調(diào)節(jié) γ-氨基丁酸(GABA)、Glu的釋放。

Glu是腦內(nèi)主要的興奮性氨基酸(EAA)，對(duì)腦缺血神經(jīng)細(xì)胞具有興奮性毒性作用。郭景春等［24-25］證實(shí)電針可抑制細(xì)胞外興奮性氨基酸的過量堆積。GABA是腦內(nèi)的主要抑制性氨基酸，有證據(jù)表明［26-27］，GABA可能通過超極化神經(jīng)元膜電位并抑制Glu能的遞質(zhì)釋放而對(duì)抗腦缺血時(shí)Glu的神經(jīng)毒作用。電針預(yù)處理對(duì)腦缺血的腦保護(hù)作用機(jī)制是否與Glu和GABA有關(guān)，尚未檢索到相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測(cè)電針預(yù)處理的腦缺血大鼠紋狀體內(nèi)Glu和GABA的動(dòng)態(tài)變化，探討電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 將18只2～3月齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(清潔級(jí)，體質(zhì)量250～300 g，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組、缺血組和電針預(yù)處理組，每組6只。

1.2 電針預(yù)處理 在大鼠清醒狀態(tài)下，用自備繩子將大鼠四肢固定在自制木板上，參照華興邦大鼠穴位圖譜，選取督脈經(jīng)穴百會(huì)(GV20)、大椎(GV14)兩穴?！鞍贂?huì)”位于頂骨正中，“大椎”在第7頸椎與第1胸椎間，背部正中。以0.5寸毫針向前平刺百會(huì)約3 mm，斜刺大椎約10 mm，在兩穴上接電針刺激儀形成閉合電流環(huán)路。電流強(qiáng)度以大鼠耳朵微顫為穴位刺激有效指標(biāo)，疏密波(2/15 Hz)，刺激 30 min，1 次/d，共 5 d。假手術(shù)組和缺血組無電針治療。

1.3 微透析留置管的植入及大腦中動(dòng)脈缺血(MCAO)模型的建立 電針預(yù)處理結(jié)束后第2天，用10%的水合氯醛(35 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠;將大鼠固定于立體定位儀上，切開頭皮，暴露顱骨;于坐標(biāo)為前囟向尾側(cè)4.6 mm，中線偏外側(cè)4 mm，深3.0 mm處鉆2 mm大小的孔，植入一自制不銹鋼留置管于大鼠紋狀體區(qū)，并用牙托粉固定。把植入留置管的大鼠仰臥位放在頭下方有一直徑為2 cm大小孔洞的木板上(防止留置的透析管脫落)。缺血組和電針預(yù)處理組參照Longa法制備大鼠中動(dòng)脈缺血(middle cerebral artery occlusion)模型［28］。假手術(shù)組只分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，而不結(jié)扎和放置線栓。

1.4 微透析采樣 以人工腦脊液作為腦內(nèi)微透析灌流液［29］，用MD21001型針管式微量注射泵進(jìn)樣。大鼠麻醉后取俯臥位，頭水平位固定在立體定位儀上并在麻醉狀態(tài)下取樣:(1)置入微透析探針:把平衡好的微透析探針插入已埋好留置管的大鼠腦內(nèi)，將微透析探頭(有效透析膜長(zhǎng)度4 mm，MAB6.14.4探針，Stainless Steel)經(jīng)留置管插入腦內(nèi)，入口端通過塑料導(dǎo)管與微透析泵(MD-0100，bioanalytical system，USA)的注射器相連，出口端通過導(dǎo)管連接0.5 ml離心管，以收集透析液用于高效液相測(cè)定。(2)收集流出液:將平衡好的微透析探針插入已埋好留置管的大鼠腦內(nèi)，流速為1 μl/min平衡90 min，收集所有流出液于一個(gè)微量管里，繼續(xù)平衡30 min，收集所有流出液于另一微量管里。(3)收集對(duì)照液:維持流速2 μl/min在紋狀體區(qū)進(jìn)行微透析，測(cè)定微透析液中氨基酸含量的變化。每10 min收集1管透析液，共收集20 ml。分別在缺血前，插入線栓后 40、80、120 min，再灌注后 40、80、120、160、200、240 min 時(shí)收集透析液，整個(gè)過程共收集10管透析液。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用高效液相色譜(HPLC)-熒光檢測(cè)法測(cè)定透析液中的Glu和GABA變化。

1.5 Glu和GABA遞質(zhì)的測(cè)定 參考顧擁軍等［29］的方法，用高絲氨酸作內(nèi)標(biāo)，采用鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生法行高效液相色譜分析。用保留時(shí)間做定性分析，峰面積內(nèi)標(biāo)法做定量分析。

1.6 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 在缺血再灌注后24 h、處死大鼠之前對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，參照Zea-Longa五分制評(píng)分法:0分為無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀;1分為不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪;2分為爬行時(shí)轉(zhuǎn)圈;3分為向?qū)?cè)傾倒;4分為不能自行行走，意識(shí)喪失。評(píng)分為1～3分的為造模成功，并選入相應(yīng)組別。

1.7 TTC染色 再灌注24 h神經(jīng)功能損害評(píng)估完成后，立即給予過量的水合氯醛處死大鼠。迅速斷頭取腦，將腦放入-20℃冰箱中約15 min，然后用刀片從大腦額極至枕極連續(xù)冠狀位切片5片，每片厚約2.5 mm，把腦片浸入到2%TTC磷酸鹽緩沖液中(pH=7.4)，并用錫箔紙避光染色30 min。染色結(jié)束后，電針預(yù)處理組和缺血組可以看到梗死區(qū)域，而假手術(shù)組中沒有見到梗死區(qū)。用數(shù)碼相機(jī)拍照腦片，然后計(jì)算腦梗死體積。每層腦片的梗死面積乘以腦片厚度就是該層腦片的梗死體積，5層梗死體積之和就是總梗死體積。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，整體比較先采用重復(fù)測(cè)量方差分析，再按時(shí)間點(diǎn)分層采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)進(jìn)行組別間比較，按組別分層采用重復(fù)測(cè)量方差分析進(jìn)行時(shí)間點(diǎn)間比較，具體時(shí)間點(diǎn)兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。組間兩兩比較采用Tukey法。

2 結(jié)果

2.1 Glu水平比較 假手術(shù)組缺血及再灌注各時(shí)間點(diǎn)與缺血前比較均無顯著性差異(P＞0.05)。缺血組大部分時(shí)間點(diǎn)(除外再灌注80 min和240 min)與缺血前比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);與缺血前水平相比，Glu水平在缺血40 min開始升高(P＜0.01)，80 min升高到峰值(P＜0.01)，120 min仍保持較高水平(P＜0.01)。再灌注后開始下降，再灌注80 min時(shí)下降至正常水平，至120 min時(shí)發(fā)生二次升高(P＜0.01)，160 min時(shí)達(dá)二次升高高峰(P＜0.01)。200 min后又降至正常(P＜0.01)，直至240 min一直保持正常水平。電針預(yù)處理組缺血及再灌注各時(shí)間點(diǎn)Glu水平與缺血前比較差異趨勢(shì)與缺血組基本一致:缺血開始先迅速升高，直至40 min時(shí)達(dá)到最高水平(P＜0.01)，80 min(P ＜0.01)、120 min(P ＜0.01)仍處于較高水平;再灌注時(shí)開始下降，到80 min時(shí)處于正常水平，然后開始回升，160 min升至一個(gè)小高峰(P＜0.01)，然后又開始下降，直至240 min再次降至正常水平。

組間比較結(jié)果顯示:除再灌注80 min和240 min外，缺血組大部分時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較有顯著升高(P＜0.01);除再灌注80 min和240 min外，電針預(yù)處理組大部分時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較有顯著升高(P＜0.01)，電針預(yù)處理組的Glu水平在缺血40、80、120 min和再灌注后120、160 min等時(shí)間點(diǎn)與缺血組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較有顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。見表1。

表1 清醒大鼠腦缺血再灌注期間紋狀體透析液中Glu水平的變化(±s，μmol/L)

表1 清醒大鼠腦缺血再灌注期間紋狀體透析液中Glu水平的變化(±s，μmol/L)

注:與缺血前比較，＊＊P＜0.01;與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01;與缺血組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

時(shí)間 假手術(shù)組 缺血組 電針預(yù)處理組缺血前3.60±0.69 3.62±0.80 3.60±0.71缺血時(shí)間 40 min 3.62±0.93 28.23±5.85＊＊△△ 22.66±5.13＊＊△△#80 min 3.80±0.88 34.02 ±7.03＊＊△△ 17.83 ±3.87＊＊△△##120 min 3.92±0.89 32.41 ±5.87＊＊△△ 19.12 ±3.95＊＊△△##再灌注時(shí)間 40 min 3.58±1.28 12.12±7.50＊＊△△ 10.28±3.41＊＊△△80 min 3.17±0.95 3.55±0.77 3.51±1.07120 min 3.24±0.77 8.76 ±3.04＊＊△△ 5.64 ±1.62＊＊△△#160 min 3.16±0.86 13.22 ±4.13＊＊△△ 5.86 ±1.60＊＊△△##200 min 3.20±0.97 5.05±1.22＊＊△△ 5.69±1.02＊＊△△240 min 3.32±0.71 3.70±1.30 3.64±0.79

2.2 GABA水平比較 假手術(shù)組缺血及再灌注各時(shí) 間點(diǎn)與缺血前比較均無顯著性差異(P＞0.05)。缺血組各時(shí)間點(diǎn)與缺血前比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);缺血40 min開始升高(P＜0.01)，120 min升高到峰值(P＜0.01)，再灌注后開始下降，下降至再灌注40 min速度較快(P＜0.01)，之后一直到再灌注240 min呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)(P＜0.01)。電針預(yù)處理組缺血及再灌注各時(shí)間點(diǎn)GABA水平與缺血前比較差異趨勢(shì)與缺血組基本一致:缺血開始先迅速升高(P＜0.01)直至120 min時(shí)達(dá)到最高水平;再灌注后開始下降，下降至再灌注40 min速度較快(P＜0.01)，之后一直到再灌注240 min呈現(xiàn)較慢下降趨勢(shì)(P＜0.01)。

組間比較結(jié)果顯示:缺血組各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較有顯著升高(P＜0.01);電針預(yù)處理組各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較有顯著升高(P＜0.01)，電針預(yù)處理組缺血40、80、120 min和再灌后160、200 min與缺血組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較有顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。見表2。

表2 清醒大鼠腦缺血再灌注期間紋狀體透析液中GABA的變化(±s，μmol/L)

表2 清醒大鼠腦缺血再灌注期間紋狀體透析液中GABA的變化(±s，μmol/L)

注:與缺血前比較，＊＊P＜0.01;與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01;與缺血組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

2.3 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較 假手術(shù)組評(píng)分為0分，缺血組為(3.17±0.41)分，電針預(yù)處理組為(2.17±0.41)分，各組之間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，電針預(yù)處理組的行為學(xué)評(píng)分明顯低于缺血組(P＜0.01)。

2.4 各組大鼠腦梗死體積比較 采用單因素方差分析對(duì)各組缺血24 h腦梗死體積進(jìn)行分析。由圖1可知，缺血組的腦梗死體積最大［(158.67±12.86)mm3］，電針預(yù)處理組腦梗死體積次之［(118.83±26.77)mm3］，假手術(shù)組則沒有發(fā)生腦梗死。電針預(yù)處理組的腦梗死體積小于缺血組腦梗死體積(P＜0.01)，說明電針預(yù)處理能夠明顯減小大鼠腦梗死體積。這與神經(jīng)功能損害評(píng)估的結(jié)果是一致的。

圖1 各組大鼠腦組織梗死體積比較

3 討論

EAA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，包括 Glu、天冬氨酸(Asp)等。1971 年 Olney［30-31］首次提出“興奮毒(excitotoxicity)”，他觀察到全身應(yīng)用Glu可導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)元的退行性病變。后來大量研究表明［32-35］，腦缺血時(shí)細(xì)胞外液EAA增高，特別是EAA中的Glu增高更為顯著，Glu的大量堆積使神經(jīng)元持續(xù)去極化，增加了神經(jīng)元內(nèi)Glu的大量釋放。有證據(jù)表明［36］，一些對(duì)缺血再灌注損傷具有腦保護(hù)作用的藥物可能是通過降低細(xì)胞外液Glu濃度、抑制Glu受體的表達(dá)從而降低Glu的興奮毒作用而實(shí)現(xiàn)的。也有研究證實(shí)，采取一定的預(yù)干預(yù)措施誘導(dǎo)的腦保護(hù)作用可能是通過降低Glu濃度而實(shí)現(xiàn)的［5］。GABA是腦內(nèi)的主要抑制性氨基酸，在腦缺血時(shí)可能通過對(duì)抗Glu的興奮毒作用而起到腦保護(hù)效應(yīng)，該效應(yīng)通過激活GABA受體復(fù)合物來增加細(xì)胞外液中GABA濃度，從而導(dǎo)致跨過突觸后膜的氯離子的流動(dòng)增加，減輕腦缺血產(chǎn)生的損傷作用［37］。近年來已有學(xué)者將GABA作為腦缺血的一種治療藥物來研究，并取得了一定成果。

腦缺血耐受的發(fā)現(xiàn)，為研究?jī)?nèi)源性腦保護(hù)作用機(jī)制提供了新的思路，而電針作為一種刺激性小且行之有效的誘導(dǎo)腦缺血耐受的方法，更成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受的機(jī)制還不是很確切，歸納起來主要有以下幾方面:(1)針刺預(yù)處理后能夠使低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)表達(dá)增加，是防止腦組織進(jìn)一步缺血壞死的代償性反應(yīng)［8］;(2)針刺預(yù)處理可以使腦組織內(nèi)腺苷(ADO)含量增高，ADO可使K+-ATP通道開放提前或加強(qiáng)，從而限制Ca2+內(nèi)流和興奮性氨基酸的釋放，繼而穩(wěn)定了神經(jīng)細(xì)胞的膜電位，使腦的能量代謝降低，從而使腦組織產(chǎn)生對(duì)氧和能量供應(yīng)障礙的耐受性［9］;(3)電針預(yù)處理可誘導(dǎo)海馬 CA1區(qū)HSP70mRNA及 HSP70的表達(dá)增強(qiáng)，提示HSP70 mRNA及HSP70的表達(dá)與針刺預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受可能有關(guān)［10］;路志紅等［11］研究發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理百會(huì)穴后，大腦皮質(zhì)缺血區(qū)周圍HSP70的表達(dá)，同樣提示電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受與大腦皮質(zhì)缺血區(qū)周圍HSP70表達(dá)增強(qiáng)有關(guān);(4)即早基因c-fos及c-fos蛋白是在受到胞外刺激后最先表達(dá)的一組基因，是聯(lián)系細(xì)胞生化改變與細(xì)胞最終刺激發(fā)生特異性反應(yīng)的中介物。孫忠人等［12］研究指出針刺預(yù)處理可上調(diào)海馬CA1區(qū)c-fos mRNA及c-fos蛋白的表達(dá)，認(rèn)為電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受機(jī)制可能與海馬CA1區(qū)c-fos mRNA表達(dá)有關(guān)。Bcl-2癌基因是細(xì)胞凋亡的重要抑制基因，研究指出，針刺預(yù)處理可誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)Bcl-2 mRNA的表達(dá)，表明電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受機(jī)制可能與海馬CA1區(qū)Bcl-2表達(dá)有關(guān)［13］;(5)白細(xì)胞介素類和腫瘤壞死因子是體內(nèi)分泌的具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的一類活性物質(zhì)，腦缺血區(qū)產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子可介導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重腦缺血損傷。王軍等［14］研究發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受機(jī)制可能與降低炎性細(xì)胞因子含量及阻斷炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。(6)阿片受體可能參與電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受機(jī)制［15］。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了電針預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦紋狀體內(nèi)Glu和GABA水平的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示，在缺血大鼠Glu動(dòng)態(tài)變化的第一個(gè)峰值(缺血80 min時(shí))和再灌注后峰值(再灌注160 min時(shí))的2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，電針預(yù)處理后Glu水平均顯著下調(diào)。與Glu變化趨勢(shì)相似，在GABA動(dòng)態(tài)變化的第一個(gè)峰值(缺血120 min時(shí))和再灌注后160、200 min的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，電針預(yù)處理后GABA水平均顯著上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)也測(cè)定了各組大鼠缺血再灌注后腦梗死體積的變化及缺血再灌注24 h后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，結(jié)果顯示電針預(yù)處理組的腦梗死體積小于缺血組的腦梗死體積，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分低于缺血組。以上結(jié)果表明電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受的保護(hù)作用可能與其下調(diào)腦缺血灌注后Glu的升高及上調(diào)GABA濃度有關(guān)，為電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受的機(jī)制研究提供了新的可能性和關(guān)注。

本實(shí)驗(yàn)初步探討了電針預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注期間Glu和GABA濃度水平的影響，推測(cè)電針預(yù)處理可能通過調(diào)整Glu和GABA濃度水平變化誘導(dǎo)缺血耐受的機(jī)制，為臨床上應(yīng)用電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦保護(hù)作用提供了更有利的依據(jù)。但是電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受的機(jī)制非常復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)也只是關(guān)注了其中的一個(gè)可能性，其確切機(jī)制還有待進(jìn)一步探討，電針預(yù)處理通過調(diào)整Glu和GABA濃度水平變化誘導(dǎo)缺血耐受更深層次的機(jī)制也有待進(jìn)一步完善。

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