猴頭菌多糖不同脫色方法的研究

蔣 俊，楊 焱 ，羅 璽，吳 迪，唐慶九，張勁松，馮志勇

1農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403;2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210095;3麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食藥用菌研究所，浙江麗水 323000

多糖是猴頭菌中的主要活性物質(zhì)，猴頭菌粗多糖含有較多的色素和大量的蛋白，多糖色素的去除可以改善粗多糖的色澤，同時(shí)脫色可以提高多糖的純度，有助于猴頭菌多糖類產(chǎn)品的開發(fā)。目前常用的多糖脫色方法有:活性炭吸附法，化學(xué)脫色法，大孔樹脂脫色等?；钚蕴繛榫甙l(fā)達(dá)的微孔構(gòu)造的黑色粉末或顆粒，無嗅無味，具有巨大的比表面積，常溫時(shí)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于水和普通溶劑［1］?；瘜W(xué)脫色又可分為氧化脫色和還原脫色，由于有機(jī)物呈現(xiàn)顏色的主要原因是π-π躍遷，化學(xué)脫色的實(shí)質(zhì)是脫色試劑在酸性或堿性介質(zhì)中通過親電作用和親核作用破壞發(fā)色基團(tuán)［2］。大孔樹脂是一類人工合成的具有多孔立體結(jié)構(gòu)的聚合物，通常所說的大孔樹脂包括大孔型離子交換樹脂和大孔吸附樹脂，兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似，不同之處在于大孔吸附樹脂不存在酸性或堿性基團(tuán)，它的吸附作用是通過樹脂表面的孔徑吸附，表面電性或形成氫鍵等達(dá)到的［3］。

不同的脫色方法不僅會對多糖脫色效果產(chǎn)生影響，而且脫色后多糖的組成會發(fā)生變化，從而影響脫色后多糖的生物活性［4］。因此篩選一種既能保證猴頭菌多糖的脫色效果又能保持或提高其生物活性的脫色方法是非常重要的。本研究應(yīng)用幾種常用的脫色方法對猴頭菌多糖進(jìn)行了脫色研究，以期找到一種合適的脫色方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

噴霧干燥的猴頭菌粗多糖(浙江慶元博瑞藥業(yè)有限公司)，透析袋;RAW264.7骨髓巨噬細(xì)胞株購自美國國家菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC);Balb/c小鼠 SPF級，8～10周齡(體重28±1 g)，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心;樹脂 D303、335、HZ202、HZ801、HZ806、HZ816、JK206、D315購自上海華震科技有限公司，MG-1、脫色1號購自滄州寶恩吸附材料科技有限公司;活性炭為國藥產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM培養(yǎng)基、無色 RPMI1640培養(yǎng)基、有色RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)均購自GIBCO公司;青霉素、鏈霉素均購自Amersco公司;細(xì)菌脂多糖(LPS)、植物凝集素(PHA)、磺胺、萘乙烯二胺鹽酸鹽均購自Sigma公司;Alamar Blue為Biosource公司產(chǎn)品;Tris、二甲亞砜(DMSO)、磷酸、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸等試劑均為國產(chǎn)分析純。

Griess試劑:準(zhǔn)確量取6.25 mL的磷酸，加蒸餾水至250 mL，接著加入2.50 g磺胺和0.25 g萘乙烯二胺鹽酸鹽，用磁力攪拌器攪拌至完全溶解，最后裝入棕色試劑瓶于4℃冰箱中保存。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BüCH公司);冷凍干燥機(jī)(Thermo Savant公司);水浴鍋(上海一恒科技有限公司);Synergy HT多功能酶標(biāo)儀(基因公司);分析天平(Sartorius公司);超低溫冰箱(Thermo Forma公司);離心機(jī)(Eppendorf公司);搖床(上海杜科自動化設(shè)備有限公司);大容量離心機(jī)(Beckman公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司);倒置顯微鏡(OLYMPAS公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(BECKMAN-COULTER公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分析方法

1.2.1.1 脫色率的測定

將猴頭菌粗多糖溶液在可見光波長(380～780 nm)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)該粗多糖溶液在可見光區(qū)內(nèi)無吸收峰，從380 nm到500 nm吸收相對穩(wěn)定，500 nm到780 nm吸收下降趨勢明顯，表明猴頭菌粗多糖溶液中色素主要吸收380 nm到500 nm的可見光，因此實(shí)驗(yàn)選擇位于380 nm到500 nm中間的450 nm為檢測波長，測定溶液的吸光度值［5］。

脫色前后的多糖溶液，13400×g離心15 min，取上清于96孔板中，用酶標(biāo)儀測樣品450 nm下的吸光度值。

1.2.1.2 多糖保留率的測定

由于粗多糖在制備時(shí)通過醇沉去除了小分子，粗多糖中還原糖含量極低，可忽略不計(jì)，用苯酚硫酸法［6］測得的總糖含量為多糖含量。

1.2.2 樹脂預(yù)處理

凝膠型離子交換樹脂HZ202，大孔離子交換樹脂 D303、335、JK206、D315、脫色1 號預(yù)處理:先用蒸餾水清洗至無泡沫、無渾濁，再用1 mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡4 h，倒出堿液，用蒸餾水漂洗至中性。接著將樹脂用1 mol/L的鹽酸溶液浸泡4 h，倒出酸液，用蒸餾水漂洗至中性;再用1 mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡4 h，倒出堿液，用蒸餾水漂洗至近中性。

大孔吸附樹脂 HZ801、HZ806、HZ816、MG-1 預(yù)處理:用95%乙醇攪拌浸泡4 h，使其充分溶脹，然后用乙醇重復(fù)洗至上清液在試管中加3倍水不顯渾濁為止，再用蒸餾水洗至無醇味，備用。

1.2.3 猴頭菌多糖脫色方法的比較

1.2.3.1 活性炭脫色多糖的制備

配制10 mg/mL的猴頭菌多糖溶液，6471×g離心30 min，取上清，活性炭用量為1%，溫度為50℃，脫色60 min;測定脫色率和多糖保留率。

1.2.3.2 雙氧水脫色多糖的制備

配制10mg/mL的猴頭菌多糖溶液，6471×g離心30 min，取上清，用氨水調(diào)pH至8.0，加入3%的30%的雙氧水，60℃水浴180 min，調(diào)pH至7.0，離心取上清;測定脫色率和多糖保留率。

1.2.3.3 樹脂脫色多糖的制備

配制10 mg/mL的猴頭菌多糖溶液，6471×g離心30 min，取上清，100 mL上清加入20 mL的大孔樹脂，搖床中120 rpm、25℃脫色6 h，離心取上清;測定脫色率和多糖保留率。

1.2.3.4 體外免疫實(shí)驗(yàn)樣品的制備

將脫色率和多糖保留率較高的樣品離心取上清過分子截流量為3500的透析袋，除去小分子，袋內(nèi)的猴頭粗多糖水溶液冷凍干燥進(jìn)行體外免疫活性研究。

1.2.4 大孔樹脂的篩選

取1.2.2中的十種大孔樹脂各10 mL，每種大孔樹脂三個(gè)平行，與50 mL 10 mg/mL的猴頭多糖(6471×g離心30 min)溶液混合，迅速搖勻后取樣，為初樣，將三角瓶放到搖床中，溫度設(shè)為25℃，120 rpm，脫色9 h;分別計(jì)算各樹脂脫色后的脫色率和多糖保留率，選取脫色率和多糖保留率高的樣品進(jìn)行體外免疫活性研究。

1.2.5 樣品刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取5 mg左右的樣品于滅過菌的Eppendorf離心管中，用 PBS(含 0.14 mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl，0.004 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，pH 為7.4)配成5 mg/mL 的溶液，13400 ×g離心30 min，無菌操作臺中將上清轉(zhuǎn)入滅菌管中，用 PBS 將樣品稀釋至 2 mg/mL、1 mg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、100 μg/mL。細(xì)胞懸液的制備參照文獻(xiàn)［7］，細(xì)胞濃度稀釋至 5 ×105個(gè)/mol，將細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔180 μL，然后加入20 μL待測樣品，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以LPS(10 μg/mL)為陽性對照，PBS為陰性對照，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，取上述96孔板中上清100 μL于酶標(biāo)條中，加入50 μL的 Griess試劑，靜置10 min，測定543 nm下的吸光度值。

1.2.6 樣品刺激脾淋巴細(xì)胞增殖的試驗(yàn)

樣品用 PBS稀釋至 2 mg/mL、1 mg/mL、500 μg/mL。小鼠脾淋巴細(xì)胞液的制備參照文獻(xiàn)［8］，細(xì)胞濃度稀釋至2×106個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔180 μL，再加入20 μL樣品，分別以20 μL PBS和 20 μL 60 μg/mL 的 PHA 溶液作陰性和陽性對照。于37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，每孔加入20 μL Alamar Blue試劑，用酶標(biāo)儀測定其在570 nm和600 nm處的吸光度值，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，測定其在570 nm和600 nm處的吸光度值，應(yīng)用Alamar Blue試劑的計(jì)算公式算出各樣品對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，增值率為樣品與陰性對照的比值。

計(jì)算公式:

2 結(jié)果與討論

2.1 三種脫色方法的比較

2.1.1 三種脫色方法對多糖脫色率和保留率的影響

由表1可以看出大孔樹脂的脫色率明顯高于其它兩種脫色方法?；钚蕴窟m合于吸附非極性化合物色素，而粗猴頭多糖在制備過程中經(jīng)過醇沉去除了大部分非極性小分子色素，故活性炭不適合于粗猴頭多糖的脫色;雙氧水在該脫色條件下脫色率較低，可能由于雙氧水用量過低導(dǎo)致，在將雙氧水的用量提高到5%時(shí)，脫色率可達(dá)到67%，在此條件下，進(jìn)一步研究了雙氧水對多糖活性的影響。

表1 三種不同脫色方法得到的脫色率和多糖保留率Table 1 Comparison of three different decolorizing methods

2.1.2 雙氧水脫色與未脫色多糖刺激巨噬細(xì)胞的活性比較

猴頭菌多糖經(jīng)雙氧水脫色后體外刺激巨噬細(xì)胞的活性較未脫色猴頭多糖顯著下降(圖1)，在P＜0.05水平，每個(gè)濃度兩組數(shù)據(jù)都存在顯著性差異，雙氧水脫色的過程可能會通過氧化破壞多糖的活性基團(tuán)，從而使多糖活性下降。

圖1 雙氧水脫色與未脫色多糖體外刺激巨噬細(xì)胞能力的比較Fig.1 Comparison of effects of activating macrophages of polysaccharide before and after H2O2decolorization

2.1.3 大孔樹脂脫色前后刺激巨噬細(xì)胞的活性比較

大孔樹脂D315脫色后活性較未脫色樣品顯著增強(qiáng)(圖2)，大孔樹脂D315在低濃度組和高濃度組與未脫色樣品均存在顯著性差異(P＜0.05)，而D303在每個(gè)濃度組與未脫色樣品無顯著性差異，表明D303脫色后多糖活性無顯著性變化。大孔樹脂脫色主要是通過吸附和離子交換作用，而作為免疫調(diào)節(jié)劑的多糖大多屬于大分子弱極性，不容易被樹脂吸附，所以脫色后的多糖活性不會降低。

圖2 樹脂脫色與未脫色多糖體外刺激巨噬細(xì)胞能力的比較Fig.2 Comparison of effects of activating macrophages of polysaccharide before and after resin decolorization

脫色前后猴頭菌多糖脫色率、多糖保留率及體外免疫活性的分析結(jié)果表明，大孔樹脂法的脫色率遠(yuǎn)高于活性炭法，高濃度的雙氧水可以達(dá)到與大孔樹脂相當(dāng)?shù)乃?，但其脫色多糖的免疫活性顯著降低，而大孔樹脂脫色后多糖的體外免疫活性無降低，故大孔樹脂更適用于猴頭菌多糖的脫色。

2.2 十種大孔樹脂的篩選

2.2.1 十種大孔樹脂對脫色率和多糖保留率的影響

由表2可以看出 HZ202、JK206、D303、脫色一號四種樹脂的脫色率較高，多糖保留率較低，而335、D315具有較高的多糖保留率，綜合考慮脫色率和多糖保留率，挑選 HZ202、JK206、335、D315、D303、脫色一號等六種樹脂進(jìn)一步篩選。

表2 十種樹脂脫色效果的比較Table 2 Comparison of decolorization results of polysaccharide using ten types of resins

2.2.2 樣品刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的作用

由圖3可知D315脫色后的多糖活性最好，其次是335、D303、脫色一號，再次是HZ202;JK206脫色后的多糖活性遠(yuǎn)低于前面的五種樹脂脫色后的多糖，且與D315、335、D303、脫色一號、HZ202，脫色后的多糖間存在顯著性差異(P＜0.05)。

圖3 不同樹脂脫色的多糖對體外刺激巨噬細(xì)胞能力的影響Fig.3 Comparison of effects of activating macrophages of polysaccharide before and after decolorization with six types of resin

2.2.3 樣品刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的作用

由圖4可知，經(jīng)大孔樹脂335、D315、D303、脫色一號脫色后的多糖活性較好。335在中濃度時(shí)，活性最好，高濃度活性下降;D315活性隨濃度升高而升高;D303三個(gè)濃度的活性相當(dāng)，而脫色一號中濃度活性好，低濃度和高濃度時(shí)都較中濃度低。樣品中可能存在兩類物質(zhì)，一類是促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的，另一類是抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的，經(jīng)過脫色過程可能會去除一些抑制性成份，試驗(yàn)結(jié)果中表現(xiàn)出的活性可能是兩者平衡的結(jié)果。

圖4 不同樹脂脫色后的多糖刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的比較Fig.4 Comparison of the effects of proliferation of mouse spleen lymphocyte by polysaccharide after decolorization with five types of resin

從巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的作用和小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，經(jīng)大孔樹脂335、D315、D303、脫色一號脫色后的多糖都具有較好的活性，且D315表現(xiàn)出良好的濃度依賴性，其它三種樹脂脫色后多糖在刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)中都有高濃度抑制出現(xiàn)(高濃度活性低于低濃度)，可能經(jīng)樹脂脫色后，有一些抑制活性的成份殘留，查閱有關(guān)文獻(xiàn)［9］發(fā)現(xiàn)D315在檸檬酸的生產(chǎn)中已應(yīng)用多年，安全性上要好于其它樹脂。

3 結(jié)論

對脫色劑的選擇應(yīng)綜合考慮脫色效果與多糖損失，選擇脫色劑的種類不僅要從脫色效果的角度考慮，也要從多糖分離后的用途考慮。如果后續(xù)工作是單獨(dú)的生化研究，則重在考慮脫色效果，而如果分離后的用途主要為多糖的生物活性的應(yīng)用，則重在考慮減少多糖的損失，作適當(dāng)脫色即可［10］。據(jù)此原則，樹脂脫色法脫色率較高，脫色多糖生物活性較好，故選擇樹脂脫色法進(jìn)行猴頭菌多糖的脫色;樹脂型號眾多，不同樹脂吸附色素、蛋白及多糖的能力存在差異，所以脫色后粗多糖的成份各不相同，最終導(dǎo)致脫色率、多糖保留率及生物活性的差異，對十種樹脂進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)D315樹脂的多糖保留率較高，加之生物活性及安全性較好，因此大孔弱堿性陰離子樹脂D315較適合用于猴頭菌粗多糖的脫色。

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