翹鱗肉齒菌多糖的抗氧化活性分析

鄭 義 ，王衛(wèi)東，孫月娥，朱園園，郭 靜

1徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院;2江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，徐州 221000

翹鱗肉齒菌(Sarcodon aspratus)，屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、齒菌科，子實(shí)體似虎掌生長在地上，外表具淺黃褐色茸毛和虎皮紋路，故俗稱黑虎掌菌。卯小嵐［1］在《中國大型真菌》中提到翹鱗肉齒菌子實(shí)體中含有較豐富的多糖類物質(zhì)。子實(shí)體還含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素等營養(yǎng)成分。翹鱗肉齒菌多糖具有一定的藥理作用，通過誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α和NO［2］、刺激小鼠淋巴細(xì)胞增殖［3］，而表現(xiàn)出較好的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能，此外還具有抗病毒、抑菌的作用。目前對翹鱗肉齒菌多糖抗氧化活性的研究鮮見報道。本實(shí)驗(yàn)以翹鱗肉齒菌子實(shí)體為研究對象，采用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇分級沉淀多糖，分析翹鱗肉齒菌多糖的抗氧化活性，以期為翹鱗肉齒菌多糖開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;THZ-82恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司;標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩，浙江上虞華美儀器紗篩廠;風(fēng)選中藥粉碎機(jī)，山東省青州市精誠機(jī)械制造有限公司;FA2104N電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司;SENCO R201L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申生科技有限公司;SIGMA 3K30高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司。

1.2 材料與試劑

翹鱗肉齒菌購自云南麗江市云麓商貿(mào)有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma 公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 翹鱗肉齒菌多糖的提取

將翹鱗肉齒菌用清水洗凈，適當(dāng)切塊，50℃下干燥，恒重后粉碎，過60目篩，干燥保存待用。稱取翹鱗肉齒菌子實(shí)體干粉200 g，加適量水(液料比30 mL/g)，85℃水浴3 h，即得多糖提取液。多糖提取液進(jìn)行減壓抽濾、濃縮、4℃下醇析、離心、干燥后得沉淀，所得沉淀用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌兩次后，冷凍干燥后得翹鱗肉齒菌粗多糖。翹鱗肉齒菌粗多糖采用Sevag法脫蛋白。然后用自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h。透析液濃縮后冷凍干燥得翹鱗肉齒菌多糖。

1.4 翹鱗肉齒菌多糖的乙醇分級沉淀

翹鱗肉齒菌多糖加適量的水復(fù)溶，制成多糖水溶液，依次用體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%的乙醇于4℃冰箱中分級沉淀。冷凍干燥后得翹鱗肉齒菌多糖組分 SAP-1、SAP-2、SAP-3、SAP-4和SAP-5，備用。稱量各組分0.5 g，用蒸餾水配制成20 g/L母液，4℃保存，備用。

1.5 抗氧化活性測定

1.5.1 DPPH自由基清除率測定

DPPH自由基清除率測定參考Wu的方法［4］，將 SAP-1、SAP-2、SAP-3、SAP-4 和 SAP-5 母液用蒸餾水稀釋至不同的質(zhì)量濃度(0.01～0.25 g/L)，制備成翹鱗肉齒菌多糖樣品溶液。分別移取各樣品溶液樣液1.5 mL，再加入 1.5 mL 含 0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇，混合、振蕩，在室溫下避光放置30 min，然后在波長517 nm處檢測吸光度。以Vc作為陽性對照。

清除率計(jì)算公式如下:

式中，Ac為對照組吸光值，1.5 mL蒸餾水加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇;Ai為樣品組吸光值，1.5 mL 樣品液加1.5 mL 含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇;Aj為空白組吸光值，1.5 mL樣品液加1.5 mL 95%乙醇。

1.5.2 還原力測定

還原力測定方法采用Oyaizu［5］報道的方法。量取不同質(zhì)量濃度(0.01～0.1 g/L)的樣液2 mL，加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖液2 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%(w/w)的鐵氰化鉀［K3Fe(CN)6］溶液2 mL，混勻，50℃水浴下保溫20 min，再加入10%(w/w)的三氯乙酸(TCA)溶液2 mL，震蕩混勻后，以3000 rpm離心10 min。取離心后的上清液2 mL，加入2 mL 去離子水和0.4 mL 0.1%(w/w)的 FeCl3溶液，震蕩混勻后在50℃水浴下保溫10 min，當(dāng)體系溶液顏色由黃色變?yōu)樗{(lán)色時，在波長700 nm下測定其吸光度值A(chǔ)700，樣品吸光值越大則其還原能力越大。以去離子水代替樣品作為空白對照，Vc作為陽性對照。

1.5.3 羥基自由基清除率測定

羥基自由基清除率測定采用鄰二氮菲比色法［6］。樣品溶液質(zhì)量濃度為 0.01～10 g/L，以 Vc作為陽性對照。

損傷管:取0.5 mL 0.75 mmol/L 鄰二氮菲的無水乙醇溶液加入1 mL 0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.40)和0.5 mL去離子水，充分混勻后加入0.5 mL 0.75 mmol/L 的 FeSO4，混勻后再加入 0.5 mL 0.01%(V/V)的 H2O2，37 ℃水浴60 min 后，536 nm下測其吸光值為A損;未損傷管:以0.5 mL去離子水代替損傷管中的H2O2，重復(fù)上述操作步驟，測其吸光值為A未損;樣品管:0.5 mL樣品溶液代替損傷管中的去離子水，測其吸光值為A樣;樣品參比:取1 mL 0.15 mol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH 7.40)和0.5 mL樣品溶液混合，加入1.5 mL去離子水，不需水浴，測其吸光值為 A參;空白參比:取1 mL 0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.40)加入2 mL去離子水，作為空白調(diào)零A空，計(jì)算不同樣品對羥基的清除率:

1.5.4 鐵離子螯合能力測定

鐵離子鰲合能力的測定采用 Decker［7］的方法，略有改動。在2 mL不同質(zhì)量濃度(0.5～20 g/L)的樣品溶液中，加入0.02 mL 5 mmol/L的FeCl2，再加0.2 mL 5 mmol/L Ferrozine，室溫下靜置 10 min，加入等體積的蒸餾水，搖勻，于562 nm下測量吸光度。上述反應(yīng)體系中，以蒸餾水替代樣品溶液作為空白對照，EDTA作為陽性對照。每個樣品平行測定3次，取其平均值。鐵離子鰲合能力計(jì)算公式如下:

式中，A0為空白對照的吸光度;A1為樣品或陽性對照的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 清除DPPH自由基的能力

DPPH法是評價抗氧化活性的常用方法，抗氧化物質(zhì)可直接作用于DPPH自由基，使其顏色變淺，根據(jù)吸光度的變化可測定物質(zhì)的抗氧化活性。由圖1可知，在測定的質(zhì)量濃度范圍，翹鱗肉齒菌各個多糖組分對DPPH自由基的清除能力呈現(xiàn)出劑量依賴性，清除DPPH自由基的能力隨著質(zhì)量濃度的增大而增大。

質(zhì)量濃度為0.05 g/L時，翹鱗肉齒菌的5個多糖組分中，SAP-4的清除率最高，為70.02%，SAP-3次之，為61.19%，SAP-1、SAP-2和 SAP-5的清除率分別為55.24%、45.75%和 58.12%。質(zhì)量濃度為0.1 g/L 時，SAP-4 的清除率為94.97%，SAP-3 的清除率為87.62%，其余組分的清除率均在80%以下。質(zhì)量濃度為0.2 g/L時，5個組分的清除率均達(dá)到90%以上，SAP-4的清除率仍為最高，達(dá)94.97%。由此可見，SAP-4具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，其次是SAP-3。當(dāng)質(zhì)量濃度低于0.1 g/L時，各個組分對DPPH自由基的清除能力均低于陽性對照Vc;而當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.1 g/L時，SAP-4的清除率高于Vc。

EC50值是指清除率為50%時的樣品質(zhì)量濃度，EC50值可作為評價抗氧化能力的重要參數(shù)。如某種物質(zhì)的EC50值低于10 g/L，則表明其具有很好的抗氧化活性［8］。采用Logit回歸可分別計(jì)算出各多糖組分及Vc的EC50值(表1)。各多糖組分中，SAP-4的 EC50值最小，為 0.029 g/L，其次是 SAP-3，為0.037 g/L。由EC50值可判斷5個組分對DPPH自由基均具有較強(qiáng)的清除能力，其強(qiáng)弱順序?yàn)?SAP-4＞ SAP-3＞ SAP-5＞ SAP-1＞ SAP-2。Vc的EC50值為0.024 g/L，由此表明SAP-4清除DPPH自由基的能力與Vc基本相當(dāng)。

表1 翹鱗肉齒菌各多糖組分對DPPH自由基清除能力的EC50值Table 1 EC50values of polysaccharides fractions from S.aspratus on DPPH radical scavenging effects

有關(guān)真菌多糖清除DPPH自由基能力已有較多報道，劉劍利等［9］對質(zhì)量濃度均為0.1 g/L的粗提液、醇沉、離子交換和凝膠過濾等四種不同純化階段的香菇菌絲體多糖進(jìn)行DPPH自由基清除率比較，結(jié)果表明四種純化階段的多糖的清除率分別為9.61%、21.33%、43.58% 和 65.06%。由此可見，翹鱗肉齒菌多糖的各個組分對DPPH自由基的清除能力均顯著高于香菇菌絲體多糖，說明翹鱗肉齒菌多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

2.2 還原力

抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性與其還原力存在著直接的聯(lián)系，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。由圖2可知，在0.01～0.1 g/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，翹鱗肉齒菌各多糖組分的還原力隨著濃度的增加而增加，其中SAP-4的還原力最強(qiáng)，當(dāng)濃度為0.05 g/L時，吸光度為0.603;當(dāng)濃度為0.1 g/L時，吸光度則達(dá)到了1.108。而在0.05 g/L時，陽性對照Vc的吸光度為0.772，濃度為 0.1 g/L 時，吸光度為 1.381。對于分光光度法而言，吸光度高于1.0之后測量結(jié)果的相對誤差較大，故不再進(jìn)一步加大多糖質(zhì)量濃度。在已測量的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，5個多糖組分及Vc的還原能力大小的順序?yàn)?Vc＞SAP-4＞SAP-5＞SAP-3＞SAP-1＞SAP-2。

2.3 清除羥基自由基的能力

翹鱗肉齒菌多糖對羥基自由基的清除作用如圖3所示，在0.01～10 g/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，翹鱗肉齒菌各多糖組分對羥基自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增大而增大，當(dāng)質(zhì)量濃度超過1 g/L后，增幅趨于平緩。測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各組分清除羥基自由基的能力均較低，在濃度為5 g/L時，SAP-2和SAP-4的清除率相對較高，分別為 18.92%、18.22%;濃度升高到10 g/L時，各個組分的清除率均未達(dá)到 50%，SAP-2和 SAP-4的清除率為26.63%、22.49%。

Chen等［10］通過DEAE-纖維素離子交換柱和瓊脂糖凝膠CL-6B柱從香菇多糖中分離得到3個組分LEPA1、LEPB1和LEPC1，在質(zhì)量濃度為4 g/L時，3個組分對羥基自由基的清除率分別為74.2%、90.1%和90.6%。由此可見，與香菇多糖相比，翹鱗肉齒菌多糖清除羥基自由基的能力較弱。

2.4 鐵離子螯合能力

鐵離子在生物體內(nèi)能夠引發(fā)脂質(zhì)過氧化，并導(dǎo)致羥基自由基的產(chǎn)生，因此鐵離子鰲合能力也是一種重要的評價抗氧化能力的指標(biāo)。Ferrozine能夠定量的與Fe2+結(jié)合形成紅色配合物，當(dāng)有螯合劑(如EDTA、抗氧化物質(zhì))存在時，這一過程就會被干擾，導(dǎo)致紅色配合物的生成量減少，一定波長(700 nm)下的吸光度降低，據(jù)此可評價抗氧化物質(zhì)對鐵離子的鰲合能力。翹鱗肉齒菌的5個多糖組分對鐵離子的螯合能力如圖4所示。

在質(zhì)量濃度為0.5～20 g/L的范圍內(nèi)，各個組分對鐵離子的螯合能力隨著質(zhì)量濃度的增大而增大。質(zhì)量濃度為3 g/L時，SAP-4對鐵離子的螯合能力最大，為69.79%，SAP-5的螯合能力與SAP-4接近，為69.67%;質(zhì)量濃度為5 g/L時，SAP-4對鐵離子的螯合能力仍然最大，為82.06%，其余組分均未達(dá)到80%;質(zhì)量濃度為10 g/L時，鐵離子螯合能力大小依次為:SAP-4(94.92%)＞SAP-5(83.67%)＞ SAP-3(78.94%)＞ SAP-2(74.23%)＞ SAP-1(69.38%)。質(zhì)量濃度為20 g/L時，SAP-4螯合率為96.43%，其余組分未達(dá)到90%，各組分對鐵離子螯合能力的大小與10 g/L的順序一致。

各多糖組分及陽性對照EDTA對鐵離子螯合能力的EC50值如表2所示。根據(jù)EC50值，各組分對鐵離子螯合能力大小依次為SAP-4＞SAP-5＞SAP-2＞SAP-3＞SAP-1，與上述結(jié)果基本類似。各組分的EC50值均高于 EDTA(0.281 g/L)，但都低于10 g/L，表明各個組分具有較高的螯合鐵離子的能力。

表2 翹鱗肉齒菌各多糖組分對鐵離子螯合能力的EC50值Table 2 EC50values of polysaccharides fractions from S.aspratus of ferrous ions chelating ability

3 結(jié)論

乙醇分級沉淀得到的翹鱗肉齒菌多糖各個組分均表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，SAP-4的抗氧化能力最強(qiáng)。在測定的質(zhì)量濃度范圍，各個組分對DPPH自由基的清除能力均隨質(zhì)量濃度增大而增大，SAP-4清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)，EC50值為0.029 g/L，與陽性對照 Vc基本相當(dāng)。在0.01～0.1 g/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，翹鱗肉齒菌各多糖組分的還原力隨著濃度的增加而增加，其中SAP-4的還原力最強(qiáng)，濃度為0.1 g/L時，吸光度為1.108。各組分清除羥基自由基的能力均較低，在質(zhì)量濃度為10 g/L時，各個組分的清除率均未達(dá)到50%。5個多糖組分具有較高的螯合鐵離子能力，SAP-4對鐵離子的螯合能力最強(qiáng)，EC50值為 1.208 g/L。

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