甘遂中激活NF-κB信號(hào)通路的化學(xué)成分

陳曉珍，張婷婷，2，李國(guó)友，方冬梅，張國(guó)林，羅應(yīng)剛*

1中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041;2中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049

常用中藥甘遂為大戟科植物甘遂(Euphorbia kansui T.N.Liouex T.P.Wang)的干燥塊莖，又名苦澤、干澤，因采掘時(shí)易腫手，山西俗稱“腫手花根”［1］。該藥材主要產(chǎn)于陜西、山西、河南、甘肅、河北、寧夏、內(nèi)蒙古等地。甘遂苦寒有毒，歸肺、腎、大腸經(jīng)，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其具有瀉水逐飲的功效，現(xiàn)代藥理研究表明其在抗腫瘤、治療重癥胰腺炎等方面具良好療效［2］，臨床常用來治療晚期食道癌、乳腺癌等惡性腫瘤以及哮喘、慢性支氣管炎等癥。甘遂植物全株有毒，尤其根毒性較大;對(duì)皮膚和粘膜有刺激作用，食用過量出現(xiàn)腹痛、下瀉、嘔吐、脫水、嚴(yán)重時(shí)呼吸困難、循環(huán)衰竭而死亡，近年來對(duì)其化學(xué)成分和藥理作用的研究不乏報(bào)道［3-5］。

NF-κB(Nuclear Factor-kappa B)是涉及機(jī)體防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激、細(xì)胞分化和凋亡以及腫瘤生長(zhǎng)抑制過程中信息傳遞的一類重要核因子，它在炎癥反應(yīng)以及腫瘤生長(zhǎng)等過程中起著重要作用［6］。臨床廣泛應(yīng)用的甘遂具有明顯的毒副作用，主要表現(xiàn)在對(duì)皮膚、眼睛的刺激作用，促使炎癥發(fā)生。我們以NF-κB信號(hào)通路為炎癥測(cè)試模型，對(duì)甘遂95%乙醇提取物以及各溶劑萃取物進(jìn)行NF-κB信號(hào)通路激活測(cè)試。在此基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)激活NF-κB信號(hào)通路作用最強(qiáng)的部位為非極性部位，因此我們采用GC-MS技術(shù)分離、分析并鑒定了該非極性部位中的化學(xué)成分并運(yùn)用峰面積歸一化法確定了各成分的相對(duì)含量。

1 材料與儀器

甘遂(產(chǎn)地:山西，生產(chǎn)批號(hào):1005114)購(gòu)于四川新荷花中藥飲片公司，由中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所高信芬研究員鑒定為大戟科植物甘遂(Euphorbia kansui T.N.Liou ex T.P.Wang)的塊莖。

Hela細(xì)胞菌株購(gòu)于上海工碩生物技術(shù)有限公司;pNF-κB-luc(報(bào)告基因質(zhì)粒)、pTNF-α-promoterluc(報(bào)告基因質(zhì)粒)、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所;DMEM(高糖)培養(yǎng)液為Invitrogen公司生產(chǎn)的試劑盒。

GC(Focus)-MS(Polaris Q)聯(lián)用儀(Thermo Scientific);色譜柱為ThermoTR-5ms SQC毛細(xì)管柱(30 m ×0.25 mm i.d.，0.25 μmd.f.)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 甘遂粗提物、萃取物及非極性部位的制備

將20 kg干燥的甘遂粉碎后，用95%乙醇冷浸3次，每次用乙醇60 L浸泡7 d，將三次冷浸液回收濃縮后得粗提物(915 g)。將粗提物用5 L熱水分散后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每次用溶劑5 L，分別萃取三次。將上述制備的粗提物、各溶劑萃取物用于NF-κB信號(hào)通路活性測(cè)試。

選取激活作用最強(qiáng)的氯仿萃取物(40 g)進(jìn)行硅膠柱層析，石油醚:丙酮溶劑系統(tǒng)(10∶1、5∶1、2∶1、0∶1)為洗脫液，TLC檢測(cè)合并，得C1～C10共10個(gè)部位;將得到的各部位進(jìn)行進(jìn)一步的激活NF-κB信號(hào)通路測(cè)試，其中活性最強(qiáng)的為非極性部位C1(15 g)。

2.2 NF-κB 信號(hào)通路活性測(cè)試

本實(shí)驗(yàn)以NF-κB為研究對(duì)象，將NF-κB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中，再加待測(cè)樣品到細(xì)胞培養(yǎng)液中誘導(dǎo)NF-κB的表達(dá)，通過測(cè)定熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)情況來檢測(cè)NF-κB的表達(dá)情況。如果NF-κB的表達(dá)增強(qiáng)，則所測(cè)得的熒光值相對(duì)于陰性對(duì)照值大。

2.2.1 Hela 細(xì)胞的體外培養(yǎng)

細(xì)胞的體外培養(yǎng)參照ATCC公司提供的培養(yǎng)方法操作［7］。

2.2.2 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

2.2.2.1 用10%無雌激素血清-無雙抗-有酚紅的DMEM(高糖)培養(yǎng)基將Hela細(xì)胞按2.5×105個(gè)/mL密度接種于24孔板，置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞融合率到70% ～90%時(shí)，進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染;

2.2.2.2 向 50 μL OPTI-MEM 培養(yǎng)基中加入 0.6 μgpNF-κB-luc+0.2 μg pSV-gal，混勻;將 2μL lipofectamine2000加入50 μL OPTI-MEM 培養(yǎng)基中，靜置5 min;按 DNA(μg):Lipofectamine(μL)=0.8∶2的比例，將上述質(zhì)粒溶液逐滴加入到 lipofectamine2000溶液中，再靜置20 min，形成復(fù)合物;按2.2.2.1 中每孔 100 μL 的量加入得到的復(fù)合物到上述24孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染共6 h即得。

2.2.3 樣品的活性檢測(cè)

2.2.3.1 Hela細(xì)胞共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒6 h后換成10%無雌激素血清-無雙抗-有酚紅的DMEM(高糖)培養(yǎng)液，加入各濃度組(1、10、100 μg/mL)樣品，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)對(duì)照組。

2.2.3.2 培養(yǎng)24小時(shí)后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清洗三次后每孔加入細(xì)胞裂解液150 μL。充分裂解細(xì)胞后，轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管，于10000 rpm離心1 min，并將上清液轉(zhuǎn)入干凈EP管，混勻后取50 μL加入熒光素酶底物檢測(cè)熒光素酶的活性［7］。

2.2.3.3 另取 70 μL 裂解液加入 133 μL ONPG、6 μL Mg2+及400 μL PBS的混合液，混勻后37℃水浴至黃色出現(xiàn)時(shí)測(cè)OD420。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，所得結(jié)果以表示。

2.3 甘遂激活NF-κB信號(hào)通路的非極性部位化學(xué)成分的GC-MS分析

氣相色譜條件:載氣:He，1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度:200℃;傳輸線溫度:230℃;程序升溫條件:初始溫度80℃，保持5 min后以15℃/min的速率升溫至150℃;然后以2℃/min的速率升溫至260℃;再以20℃/min的速率升溫至300℃并保持5 min;進(jìn)樣量:2 μL。

質(zhì)譜條件:離子源(EI)，溫度280℃;電子能量為70 eV，掃描質(zhì)量范圍:50～500 amu。

將GC-MS聯(lián)用分析所得各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，輸入計(jì)算機(jī)譜庫(kù)(NIST02)進(jìn)行檢索，對(duì)擬合指標(biāo)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)，同時(shí)運(yùn)用峰面積歸一化法對(duì)各化合物進(jìn)行定量分析，計(jì)算各化學(xué)成分的相對(duì)含量。

3 結(jié)果與討論

甘遂具有明顯的皮膚刺激等毒副作用，我們推測(cè)甘遂中可能含有激活NF-κB信號(hào)通路的活性成分。首先對(duì)甘遂95%乙醇粗提物和各溶劑萃取物進(jìn)行活性檢測(cè)，結(jié)果表明氯仿萃取物的活性最強(qiáng)(表1);將氯仿萃取物按極性大小分成10段，進(jìn)一步進(jìn)行活性測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非極性的第一段(C1)活性最強(qiáng)，其它各段也有不同程度激活NF-κB信號(hào)通路的活性(表2)。

表1 甘遂95%乙醇粗提物和各溶劑萃取物對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活情況Table 1 NF-κB signaling pathway activation results of 95%ethanol crude and different solvent-soluble extracts of Kansui

表2 甘遂氯仿萃取物各小段對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活情況Table 2 NF-κB signaling pathway activation results of sub-fractions of CHCl3-extract of Kansui

對(duì)甘遂的非極性部位C1段進(jìn)行GC-MS分析，從中共分離、鑒定了56個(gè)化合物，占總量的99.72%，主要成分為脂肪酸及其衍生物(71.23%)、長(zhǎng)鏈烷烴及其衍生物(13.73%)，還有單萜、倍半萜類(7.1%)、芳香族類(3.57%)和脂肪醛(1.12%)等(圖1，表3)。

圖1 激活NF-κB信號(hào)通路的甘遂非極性部位(C1)的GCMS總離子流圖Fig.1 GC-MS totalion chromatogramofC1 sub-fraction of CHCl3-extract of Kansui

表3 激活NF-κB信號(hào)通路的甘遂非極性部位(C1)的化學(xué)成分Table 3 Chemical constituents of C1 sub-fraction ofCHCl3extract of Kansui

11 13.80 Z，Z，Z-4，6，9-Nonadecatriene C19H34 0.09 771 12 14.71 Benzene，1，2，3，4-tetramethoxy-5-(2-propenyl)- C13H18O4 0.58 791 13 15.42 Z，Z-2，5-Pentadecadien-1-ol C15H28O 0.17 787 14 16.75 3，7-Dimethyl-6-nonen-1-ol acetate C13H24O2 0.06 796 15 17.40 Methoxyacetic acid，3-tridecyl ester C18H32O3 0.54 850 16 18.22 Icosapent C20H30O2 0.31 800 17 18.65 Ethanol，2-(octadecyloxy)- C20H42O2 0.36 782 18 20.13 Nonadecane C19H40 0.27 852 19 21.68 Oxirane，hexadecyl- C18H36O 0.39 787 20 22.57 Phenacetin C10H13NO2 0.21 999 21 23.57 Heptadecane，2，6，10，14-tetramethyl- C21H44 0.38 880 22 24.37 Heptadecane，2，6，10，15-tetramethyl- C21H44 0.29 817 23 24.75 Hexadecanoic acid，methyl ester C17H34O2 7.59 772 24 26.02 1，2-Benzenedicarboxylic acid，butyl 8-methylnonyl ester C21H32O4 0.76 775 25 27.53 Octadecanoic acid，2-(2-hydroxyethoxy)ethyl ester C22H44O4 40.84 756 26 29.55 Eicosane，7-hexyl- C26H54 0.20 812 27 31.05 9，12-Octadecadienoic acid，methyl ester，(E，E)- C19H34O2 1.51 786 28 31.35 6-Octadecenoic acid，methyl ester，(Z)- C19H36O2 3.74 839 29 31.52 cis-Vaccenic acid C20H38O2 0.34 831 30 33.40 7，11-Hexadecadienal C16H28O 0.91 839 31 33.71 Ethyl 9-cis，11-trans.-octadecadienoate C20H36O2 3.62 804 32 34.08 trans-13-Octadecenoic acid C18H34O2 9.88 778 33 34.25 11-Octadecenoic acid，methyl ester C19H36O2 0.60 793 34 34.42 Octadecanoic acid C18H36O2 0.38 791 35 36.47 Methyl 11，14-eicosadienoate C21H38O2 0.50 795 36 36.60 Heptadecane，9-hexyl- C23H48 0.19 792 37 37.56 8，11，14-Eicosatrienoic acid，methyl ester，(Z，Z，Z)- C20H34O2 0.66 770 38 38.38 Nonanoic acid，9-(3-hexenylidenecyclopropylidene)-2- C21H34O4 0.31 833 hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl ester，(Z，Z，Z)-39 41.45 9，12，15-Octadecatrienoic acid，2，3-dihydroxypropyl ester，(Z，Z，Z)- C31H64 0.22 806 40 42.96 Hentriacontane C17H32O 2.02 822 41 46.00 13-Heptadecyn-1-ol C21H44 0.34 811 42 46.73 Heneicosane C44H90 3.54 860 43 48.53 Tetratetracontane C28H58 0.48 824 44 50.35 Octacosane C28H54 2.58 842 45 52.32 Heneicosane，11-(1-ethylpropyl)- C34H70 0.72 787 46 53.87 Tetratriacontane C16H28O3 1.16 812 47 54.11 Z-(13，14-Epoxy)tetradec-11-en-1-ol acetate C27H54 0.19 795 48 55.07 Hentriacontane C25H52 0.81 811 49 57.29 Heptadecane，9-octyl- C34H70 0.77 815 50 60.62 Tetracosane，11-decyl- C20H28O6 0.50 798 51 65.28C26H28 0.29 820 52 66.20 9-Dodecyltetradecahydrophenanthrene C22H34O 0.40 726 53 66.50 5α，6α-Epoxy-3β，17-dihydroxy-16α-methylpregnan-20-one C27H42O3 0.05 780 54 66.68 Pseduosarsasapogenin-5，20-dien C28H40O4 0.10 825 55 66.95 9，12，15-Octadecatrienoicacid，2-phenyl-1，3-dioxan-5-yl ester C29H50O 1H-2，8a-Methanocyclopenta［a］cyclopropa［e］cyclodecen-11-one，1a，2，5，5a，6，9，10，10a-octahydro-5，5a，6-trihydroxy-1，4-bis(hydroxymethyl)-1，7，9-trimethyl-，(1S，1aR，2R，5R，5aR，6S，8aS，9R，10aR)-(9Cl)0.03 822

在上述鑒定的化合物中，已有研究表明不飽和 脂肪醛(Z)-7-Hexadecenal和7，11-Hexadecadienal可引起炎癥反應(yīng)，誘發(fā)神經(jīng)退行性疾病和成人呼吸道窘迫癥的產(chǎn)生等［8］，這兩種醛在甘遂非極性部位的含量分別為0.21%和0.91%。該部位中還有少量致癌物質(zhì)如苯醌類衍生物和鄰苯二甲酸酯類化合物［9，10］。在甘遂非極性部位中含量最大的是脂肪酸及酯類衍生物，且以十八碳烯酸和二十碳烯酸為主。這類脂肪酸屬于多不飽和脂肪酸，是花生四烯酸的前體物質(zhì)，在體內(nèi)炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)方面起著重要的作用［11］。一般認(rèn)為這類成分能夠抑制炎癥因子的釋放，在抗炎方面起著積極作用。按化合物中最后一個(gè)雙鍵離甲基端的距離將不飽和脂肪酸分為n-3和n-6兩類，研究表明n-3類比n-6類抗炎作用好［12］。但也有研究表明，由于不同細(xì)胞中基因和酶的差異，導(dǎo)致花生四烯酸前體物質(zhì)代謝途徑的改變，這類化合物也可能加重炎癥反應(yīng)或者誘發(fā)炎癥產(chǎn)生［11］。我們還從甘遂非極性部位中鑒定了增加癌癥發(fā)生幾率的化合物Vaccenic acid［12］，該化合物的含量約0.34%。

4 結(jié)語

我們以NF-κB信號(hào)通路為炎癥測(cè)試模型，對(duì)甘遂95%乙醇提取物及其各溶劑萃取物進(jìn)行了NF-κB信號(hào)通路激活測(cè)試。在此基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)激活NF-κB信號(hào)通路作用最強(qiáng)的部位為非極性部位。采用GC-MS技術(shù)，我們從中分離、分析并鑒定了該非極性部位中的化學(xué)成分。

甘遂非極性部位含有大量促炎成分，這些成分可能激活NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)，從而引起炎癥因子的釋放，導(dǎo)致炎癥。上述研究結(jié)果為闡明甘遂的毒效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了參考，為有效利用甘遂中的有效成分、祛除其毒副作用成分奠定了基礎(chǔ)。

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