豬糞中3種四環(huán)素類抗生素在土壤中的動態(tài)變化及降解途徑

張 健，關(guān)連珠

(1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山西太谷030801;2沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)土地與環(huán)境學(xué)院，遼寧沈陽110866)

我國自20世紀(jì)90年代初以來，飼用抗生素在畜牧業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用［1］，以亞治療劑量長期添加于動物飼料中以預(yù)防疾病促進(jìn)動物生長，在保障人類健康和促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展方面起了重要作用［2］。近年飼用抗生素年平均消費(fèi)量已達(dá)6000 t［3］，但濫用抗生素對生態(tài)環(huán)境的不良影響表現(xiàn)出越來越嚴(yán)重的趨勢，成為人們普遍關(guān)注的一個(gè)社會熱點(diǎn)問題［4－7］。研究表明，有85%以上的抗生素經(jīng)由畜禽糞尿排出體外，進(jìn)入生態(tài)環(huán)境［8］。我國大多數(shù)規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖場缺少環(huán)境治理和綜合利用設(shè)施，畜禽糞便得不到妥善處理，抗生素會隨畜禽糞便直接排入環(huán)境，造成土壤和水體的嚴(yán)重污染［9］。在養(yǎng)殖業(yè)中，四環(huán)素類抗生素(TCs)的使用范圍最廣且用量最大［10］，此類抗生素中最常用的是四環(huán)素(TTC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)，均是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類具有質(zhì)優(yōu)價(jià)廉、廣譜性特點(diǎn)的抗生素［11－12］。畜禽糞便常被作為農(nóng)家肥用于作物栽培中，四環(huán)素類抗生素隨農(nóng)家肥進(jìn)入土壤后的降解情況可能影響作物的生長狀況，并且可以預(yù)示此類抗生素的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)［6］。目前相關(guān)研究主要集中在某種畜禽糞便中四環(huán)素類抗生素殘留的降解情況［11，13－16］或在土壤中吸附解吸情況［17－19］，但有關(guān)隨畜禽糞肥進(jìn)入土壤的四環(huán)素類抗生素在土壤中降解的動態(tài)變化的研究還較少見報(bào)道，因此本試驗(yàn)通過室內(nèi)模擬培養(yǎng)試驗(yàn)，研究隨不同用量的豬糞進(jìn)入土壤的TTC、OTC和CTC數(shù)量的動態(tài)變化規(guī)律，并探討其在土壤中對各降解因子的敏感性強(qiáng)弱，為畜禽糞肥的合理利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自沈陽天柱山田間實(shí)驗(yàn)區(qū)，為黃土母質(zhì)上發(fā)育的典型棕壤，其基本養(yǎng)分含量為:有機(jī)質(zhì)含量 19.92 g/kg、全氮 0.93 g/kg、全磷 0.52 g/kg、堿解氮88.21 mg/kg、速效磷28.29 mg/kg、速效鉀67.5 mg/kg，pH 6.3。

供試豬糞采自沈陽市附近一些大型集約化畜禽養(yǎng)殖場。豬糞的基本理化性狀為:pH 6.51、有機(jī)質(zhì)含量 394.4 g/kg、全氮 27.33 g/kg、C/N 比14.43、全磷 16.46 g/kg、四環(huán)素(TTC)51.05 mg/kg、土霉素(OTC)127.06 mg/kg、金霉素(CTC)115.63 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 不同用量豬糞中四環(huán)素類抗生素在土壤中的動態(tài)變化 采用室內(nèi)模擬培養(yǎng)試驗(yàn)，共設(shè)置5個(gè)處理，即土壤中加入豬糞量(重量比)為1%、3%、5%、7%，分別用P1、P3、P5、P7表示，另設(shè)一個(gè)不加豬糞的對照(CK)。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別將豬糞與供試土壤(4Kg)混拌均勻，放入直徑28cm，高20cm的塑料盆中，每個(gè)處理重復(fù)三次，完全隨機(jī)排列。在室內(nèi)室溫(25度)下培養(yǎng)，定期攪拌，在培養(yǎng)期內(nèi)保持土壤含水量在65%左右(稱重法)，在培養(yǎng)的第0、5、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180 d用小土鉆在盆中采樣，每次采約50g土，分別測定TTC、OTC、CTC含量。

1.2.2豬糞中四環(huán)素類抗生素在土壤中降解途徑及原因分析 試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，即滅菌避光處理、未滅菌避光處理、未滅菌光照處理。具體方法為:稱取3份等量的土樣(0.5kg)于三角瓶中，經(jīng)過不同處理后加入等量豬糞(30g)進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌處理經(jīng)過高溫高壓滅菌，避光處理于恒溫培養(yǎng)箱22.5℃培養(yǎng)，光照處理于恒溫光照培養(yǎng)箱22.5℃培養(yǎng)。土層厚10 cm，晝/夜光照時(shí)間為14 h/10 h。培養(yǎng)期為50d，在培養(yǎng)期內(nèi)每5 d取一次樣(滅菌處理采樣在無菌操作臺上進(jìn)行，盡量保持其無菌狀態(tài))，共取10次樣，測定TTC、OTC、CTC含量，每個(gè)處理重復(fù)3次。

等濃度純品抗生素在土壤中的降解途徑的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法同上。

1.3 測定方法與計(jì)算

TTC、OTC、CTC含量的測定采用高效液相色譜儀［19］。稱取2 g土壤樣品，加入提取液4 mL，漩渦混勻器上2500 r/min混勻1 min，25℃超聲15 min，然后在4500 r/min的條件下離心15 min，重復(fù)兩次，集合3次上清液過微孔濾膜。用6 mL甲醇和5mL提取液活化，通過固相萃取小柱，用甲醇洗脫固相萃取小柱，氮?dú)獯蹈珊螅? mL甲醇定容，待測。TTC對照品(純度97.5%)，CTC對照品(純度99.9%)和OTC對照品(純度88.2%)均購于中國藥品生物檢定所。高效液相色譜(LC－2010－A HT)，配2487紫外檢測器，AgilentEclipseXDB－C8(4.6 ×150 mm，5μm)色譜柱，進(jìn)樣量為 20μL，流動相為0.01 mol/L，草酸∶乙腈∶甲醇(79∶10.5∶10.5，體積比)，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長268 nm。

光降解率=由表面光照引起的TCs含量減少率(滅菌光照處理與滅菌避光處理中各TCs降解率的差值)/減少總量(未滅菌光照處理各TCs降解率)×100%;

外源微生物降解率=由來自豬糞的外源微生物作用引起的TCs含量減少率(滅菌避光處理與未滅菌避光處理中各TCs降解率的差值)/減少總量(未滅菌光照處理各TCs降解率)×100%;

其他降解率=除微生物與表面光之外，其他原因引起的TCs含量減少率(滅菌避光處理中各TCs降解率)/減少總量(未滅菌光照處理各TCs降解率)×100%。

由于原來土壤中抗生素或微生物的存在，可能干擾了隨豬糞進(jìn)入土壤的這部分抗生素的變化規(guī)律，因此，文中的數(shù)據(jù)是扣除土壤中原有的抗生素的變化情況，直接分析隨豬糞進(jìn)入土壤的抗生素的變化情況及隨豬糞進(jìn)入土壤的外源微生物對抗生素的影響。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS13.0進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同豬糞用量處理土壤中四環(huán)素類抗生素的動態(tài)變化

從圖1可以看出，豬糞處理土壤中3種四環(huán)素類抗生素(TTC、OTC、CTC)在培養(yǎng)180d內(nèi)的動態(tài)變化總體趨勢一致，均呈“L”型變化，但在不同培養(yǎng)間其減少幅度不同。從整體變化趨勢來看，CTC含量在培養(yǎng)前期的減少幅度較大，而TTC、OTC含量則相對平緩。在180d時(shí)，豬糞中3種抗生素在土壤中的降解量大小的順序?yàn)镃TC＞OTC＞TTC。可見，豬糞中3種四環(huán)素類抗生素在土壤中的降解效果有明顯的差異，主要原因是由于其分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的不同，CTC反式位C5上的氫和C6位的羥基結(jié)合，可引起消除反應(yīng)，而TTC降解最慢，可能是由于TTC的C5羥基與C4二甲氨基之間形成氫鍵，4位的差向異構(gòu)難于其他抗生素。前人在研究中指出，外源抗生素在豬糞中的降解率為OTC＞TTC＞CTC［13］，添加菌劑的畜禽糞便在高溫堆肥過程中的降解率為 TTC＞CTC＞OTC［15］，外源 OTC在雞糞中的降解率大于CTC［11］，這些結(jié)果與本試驗(yàn)的結(jié)果有所不同?？梢娝沫h(huán)素類抗生素所處介質(zhì)的性質(zhì)、來源及處理方式對其降解性能有很大的影響。

圖1 豬糞處理土壤中TTC、OTC和CTC的動態(tài)變化Fig．1 Dynamics of concentration of TTC，OTC and CTC of pig manures in soil

180 d時(shí)P1～P7處理中TTC、OTC、CTC含量分別為 0.18～1.56 mg/kg、0.25～2.06 mg/kg、0.09～0.87 mg/kg。豬糞低用量處理在培養(yǎng)前期的變化已不明顯，而高用量處理則繼續(xù)保持減少的趨勢，但降幅已趨于平緩，且用量越高，變化越明顯。5 d時(shí)，豬糞中TCs在土壤中的降解速率最大，P1～P7處理的TTC、OTC、CTC的降解速率分別為0.02～0.09 mg/(kg·d)、0.03～0.18mg/(kg·d)、0.05～0.20 mg/(kg·d)。不同培養(yǎng)時(shí)期各處理的含量及降解速率差異達(dá)顯著水平(P＜0.05)。不同豬糞用量處理間同種抗生素含量均表現(xiàn)為P7＞P5＞P3＞P1，說明豬糞用量越高，其中所含的四環(huán)素類抗生素(TCs)在土壤中分解達(dá)到平穩(wěn)時(shí)所需的時(shí)間越長。隨豬糞進(jìn)入土壤的抗生素在短期內(nèi)會有較大幅度的降解，但有部分殘留，且殘留量隨豬糞施入量的增大而增大，從而加重了對土壤環(huán)境的危害。豬糞中TCs進(jìn)入土壤后，前期降解快而后期慢的原因很可能與不同濃度下抗生素被土壤吸附的形式不同有關(guān)。在高濃度時(shí)，有一大部分抗生素是以游離或物理吸附形式存在的，故容易降解;而在低濃度條件下，大部分抗生素主要以化學(xué)吸附被固定在土壤中而不易降解，并且進(jìn)入中后期土壤吸附達(dá)到飽和，吸附能力下降，因此中后期時(shí)降解比較緩慢?？梢娫诂F(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中，由于大量的畜禽糞便年復(fù)一年地施于農(nóng)田，抗生素在土壤中的累積必然會日益增加，使抗生素的污染日趨嚴(yán)重［20－21］。

2.2 不同豬糞用量處理土壤中四環(huán)素類抗生素減少率的變化

圖2顯示，豬糞處理土壤中TCs的初始降解的變化速率差異不明顯，5 d時(shí)各處理均在10% ～21%之間，低用量處理的減少率要略低于高用量處理，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，減少率之間的差距逐漸增大。30 d時(shí)同種抗生素的4個(gè)處理間減少率相差最大，此后差距逐漸縮小，說明低用量減少率的上升幅度小于高用量。CTCP1～CTCP7的減少率增加最快，TTCP1～TTCP7減少率的漲幅最小。40d左右時(shí)，已明顯可以看出3者的減少率大小為CTC＞OTC＞TTC。60d時(shí)，低用量處理減少率基本趨于平穩(wěn)，而高用量處理仍然在減少并逐步接近低用量的減少率，且在培養(yǎng)前期所有處理的減少率差異均達(dá)極顯著水平(P＜0.01)。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，CTC、OTC、TTC的P1處理減少率最大，分別為92.27%、80.47%、65.43%;P7減少率最小，分別為88.30%、76.90%、60.35%。豬糞中3種抗生素在土壤中降解平均半衰期為TTC ＞OTC＞CTC，分別為17.43 d、31.32 d、49.48 d，可見豬糞所含3種TCs在土壤中的半衰期相差較大。所有處理土壤中四環(huán)素類抗生素(TCs)的減少率均與豬糞用量呈負(fù)相關(guān)，與培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)，且用量越大，相同時(shí)間之間的相關(guān)性越強(qiáng)，但差異不顯著(P＜0.05)?？梢娯i糞中抗生素在土壤中的半衰期與其種類和施入量有關(guān)。

圖2 不同豬糞用量處理土壤中四環(huán)素類抗生素的減少率Fig．2 Dynamics of transformation percentage(%)of TCs of pig manures in soil

2.3 三種四環(huán)素類抗生素在土壤中降解途徑的研究

圖3 50 d時(shí)不同條件下TCs在土壤中的降解狀況Fig．3 Degradation of TCs in soil under different treatments at 50d

由于本試驗(yàn)主要研究豬糞施入土壤后對抗生素降解的影響，因此本試驗(yàn)的所得數(shù)據(jù)均為豬糞處理減去純品對照的差值，排除了土壤本身的影響，能更好地反映各處理豬糞中抗生素的變化情況。抗生素在土壤中會發(fā)生吸附和降解，本試驗(yàn)著重研究其降解行為，抗生素在土壤中的降解主要有微生物降解、光降解和化學(xué)降解三種途徑。3種抗生素在不同豬糞處理的降解率均高于純品對照(圖3)，3種四環(huán)素類抗生素進(jìn)入土壤后不能被完全降解。50d時(shí)，未滅菌光照處理即自然狀態(tài)下三種TCs的降解順序?yàn)镃TC ＞OTC＞TTC，分別為96.67%、92.67%、86.67%。滅菌和避光處理不同程度地減緩了3種TCs在土壤中的降解。土壤經(jīng)過滅菌處理后，微生物已經(jīng)被消除，試驗(yàn)中微生物降解的部分主要依靠來源于豬糞中的外源微生物。從圖4可以看出，在培養(yǎng)50d內(nèi)，外源微生物降解率與其他降解率均呈上升趨勢，而光降解率有所下降，但不同種類TCs的變化幅度有所差異。CTC、TTC、OTC的外源微生物降解率比對照分別提高了11.12%、17.66%、20.74%;光降解率分別降低了14.54%、21.97%、25.06%;其他降解率提高了4.08%、4.09%、4.25%，這可能由于隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，來自豬糞的外源微生物逐漸活躍起來，對抗生素的降解也有所提高，而光照只能作用于土壤表面，作用效果有限，短期內(nèi)效果明顯，其中CTC的變化最明顯。3種四環(huán)素類抗生素中，外源微生物對TTC的降解作用最大，光照對CTC的降解作用最強(qiáng)，而其他降解對3種TCs的作用相當(dāng)，這與抗生素的理化性質(zhì)有關(guān)［22－24］?？梢?，不同降解作用對同種TCs的影響不同，同種降解作用對不同TCs的影響也不同。四環(huán)素類抗生素屬于氫化并四苯環(huán)衍生物，TCs母核由A、B、C、D 4個(gè)環(huán)組成，主要官能團(tuán)包括C2位的酰胺基、C4位的二甲氨基、C10位的酚羥基等，避光可以減緩這些官能團(tuán)的破壞。研究也證明，TCs中C環(huán)C6的羥基和不穩(wěn)定的A環(huán)手性原子C4易發(fā)生差向異構(gòu)和降解反應(yīng)［25］，所以光照在一定程度上促進(jìn)TCs的降解。以往研究也指出四環(huán)素類抗生素對光照敏感，有光解特性［22，16］?？股卦诃h(huán)境中的降解與其化學(xué)特性、環(huán)境條件和使用劑量有關(guān)［2］。

圖4 不同處理?xiàng)l件TTC、OTC和CTC的降解率占降解總量的百分比Fig．4 Percentage of TTC，OTC and CTC by different degradation accounted for total

在培養(yǎng)50d時(shí)，外源微生物的降解率占降解總量的75%以上;光降解率占8%～17%;而其他作用的降解率所占比例在7%左右。說明引起豬糞中TCs進(jìn)入土壤后降解率提高的主要是外源微生物的降解。因此減少土壤中抗生素含量的有效手段是增加微生物數(shù)量，外源添加有益降解菌劑有助于抗生素藥物殘留的去除。

3 結(jié)論

1)豬糞中3種四環(huán)素類抗生素進(jìn)入土壤后含量在短期內(nèi)迅速下降，且降解速率差異顯著(P＜0.05)，中后期變化逐漸趨于平穩(wěn)，但降解速率和變化幅度因抗生素種類而異。在培養(yǎng)180 d時(shí)，豬糞中含有的3種四環(huán)素類抗生素中金霉素(CTC)在土壤中的降解效果最好，四環(huán)素(TTC)的降解效果最不明顯。

2)在一定范圍內(nèi)，豬糞中所含的TTC、OTC、CTC在土壤中的減少率和變化速率與豬糞的施入量呈一定的負(fù)相關(guān)，與培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)。低用量處理的降解效果明顯好于高用量處理。

3)豬糞中四環(huán)素類抗生素在土壤中的降解效果要好于純品抗生素，降解量的提高主要依靠外源微生物降解，在土壤中的外源微生物降解率為CTC＞OTC＞TTC，且隨著時(shí)間的延長，外源微生物的降解作用逐漸增強(qiáng)。

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